发现小分子抑制剂可以精确控制CRISPR-Cas9的基因编辑

研究人员5月2日在Cell杂志上报道，首次发现化脓性链球菌Cas9（SpCas9）蛋白的小分子抑制剂可以更精确地控制基于CRISPR-Cas9的基因组编辑。

通过开发一系列高通量生物化学和基于细胞的分析，研究人员筛选了多种小分子，以鉴定破坏SpCas9与DNA结合从而干扰其切割DNA能力的化合物。这些第一种小分子CRISPR-Cas9抑制剂很容易进入细胞，并且比先前发现的抗CRISPR蛋白小得多。这些新化合物可以对基于SpCas9的技术进行可逆和剂量依赖性控制，包括其在哺乳动物细胞中进行基因编辑，碱基编辑和表观遗传编辑的应用。

目前，SpCas9正在开发作为多种疾病的基因治疗剂，包括HIV，视力障碍，肌肉萎缩症和其他遗传性疾病。但是，这些治疗应用将极大地受益于对SpCas9活性的剂量和时间的精确控制以减少脱靶效应。控制SpCas9活动的这些方面也可以使其他应用受益，例如有效编辑模型生物的DNA以模拟和研究疾病，以及基因驱动在基因工程蚊子工程蚊子中的使用，以遏制疟疾和其他蚊子传播疾病。

对SpCas9的剂量和时间控制的需求已经产生了对抗CRISPR分子的需求。尽管存在靶向SpCas9的抗CRISPR蛋白，但它们很大并且对细胞不可渗透，在行动中不可逆转，可被蛋白酶咀嚼，并且可能在体内造成不良免疫反应的风险。相反，小分子抑制剂是蛋白水解稳定的，可逆的，并且通常是非免疫原性的，并且可以通过被动扩散容易地递送至细胞。此外，它们可以低成本大规模合成，且批次间变异性小。

在这项新研究中，Choudhary及其团队推出了一个强大灵敏且可扩展的平台，用于快速经济地鉴定和验证SpCas9的小分子抑制剂。由于SpCas9酶的特性，以高通量方式测量CRISPR-Cas9活性以允许药物筛选一直是具有挑战性的。在新论文中，Choudhary及其同事分别开发了针对SpCas9-DNA结合和SpCas9 DNA切割活性的高通量初级和二级检测。对于初步测定，他们使用称为荧光偏振的生物化学技术来监测SpCas9与含有PAM序列的荧光团标记的DNA片段之间的相互作用。在二级测定中，他们使用自动显微镜来测量由SpCas9介导的细胞中报告基因的DNA切割诱导的荧光变化。

使用这些分析技术，研究人员首先筛选了多类小分子的代表成员，以确定其成员经常抑制SpCas9的类别。该团队确定了两种先导化合物，这些化合物破坏了SpCas9在人类细胞系中以剂量依赖性方式结合DNA和抑制SpCas9介导的DNA切割的能力。由于它们通过酶阻断DNA结合，因此这些分子还抑制SpCas9的催化受损技术，包括用于转录激活的技术，并且在人血浆中是稳定的。

“这些结果为CRISPR-Cas9技术的精确化学控制奠定了基础，使得能够安全使用这些技术，”Choudhary说。 “然而，这些分子还没有为人类应用做好准备，也没有在生物体内进行功效测试。”

在未来的研究中，研究人员计划在SpCas9：gRNA复合物上鉴定抑制剂的结合位点，检查其作用机制，并优化其效力。他们还将确定分子是否与哺乳动物细胞中的其他靶标相互作用，并评估它们对其他CRISPR相关核酸酶的特异性。细胞论文中包含的早期结果表明，这些分子对其靶标非常特异，因为它们对远缘相关的CRISPR酶Cas12a没有影响。

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