研究发现：新型siRNA筛选系统精准打击HIV耐药毒株，开辟治疗新途径

文章原名为《探索结构建模和分子对接在高效siRNA筛选中的潜力：一种对抗病毒突变体的有前景的方法，以HIV-1为重点》，由Mohammad Nematian等人共同撰写。该研究发表于2024年3月11日，刊登在《Biochemical and Biophysical Research Communications》期刊上，由Elsevier Inc.出版。

本研究开发了一种优化的siRNA筛选系统，通过考虑所有必要的参数，特别是siRNA与Argonaute蛋白的两个功能域（PAZ和PIWI）之间的分子对接模拟，来设计高效的siRNA。研究团队针对HIV-1 vpr基因设计了约50个潜在的siRNA，并通过一系列实验在RAW 264.7巨噬细胞稳定细胞系中评估了它们的细胞毒性和基因沉默效率。

结果显示，筛选出的siRNA在转录和翻译水平上均显示出极低的细胞毒性和卓越的基因沉默效果。研究结果表明，所提出的siRNA筛选方法对于改善针对突变病毒，特别是HIV-1的治疗策略具有潜在的贡献。

研究亮点

• 高效的小干扰RNA（siRNA）能够助力抑制耐药性病毒的发展。

• 本研究成功识别了HIV-1病毒vpr基因中的保守序列。

• 通过一项综合性策略，研究者设计并筛选了多种针对HIV的siRNA。

• 分子对接模拟技术在精准找出最具疗效的siRNA方面发挥了关键作用。

摘要

RNA干扰技术在调控疾病相关基因方面展现出巨大应用潜力。小干扰RNA（siRNA）治疗策略已经取得了突破性进展，美国食品药品监督管理局已经批准siRNA用于特定疾病的治疗，显示出siRNA在治疗学上的巨大前景。

在siRNA治疗中，设计出高效的siRNA分子非常关键。过去的研究提出了多种设计和评估siRNA的算法和标准，但这些方法并不总能全面满足设计要求，导致siRNA的实际效果难以预测，尤其是在针对病毒突变体时。

本研究提出了一个全新的siRNA筛选系统，它综合考虑了所有关键参数，特别是siRNA与Argonaute蛋白的关键功能区域（PAZ和PIWI）的分子对接模拟，这对于确保siRNA与RNA诱导的沉默复合体（RISC）的适当相互作用至关重要。

通过这一严格筛选方法，研究团队设计并评估了约50个针对HIV-1病毒vpr基因的潜在siRNA。在RAW 264.7巨噬细胞中的实验结果显示，这些siRNA在细胞毒性极低的同时，在基因表达的转录和翻译层面上均展现出高效的沉默能力。随着siRNA治疗策略的不断进步，本研究的发现预计将促进针对包括HIV-1在内的突变病毒的治疗策略的改进。

导言

抗逆转录病毒治疗（ART）虽然在抑制HIV-1病毒复制方面取得了成效，但治疗成本高、长期副作用以及病毒对ART产生耐药性仍是亟待解决的难题。通过将核酸送入目标细胞，可以抑制HIV-1的复制和病毒产生。尽管CRISPR/Cas等基因编辑技术在临床应用中展现出潜力，但它们仍面临非特异性剪切、传递难题以及伦理和监管的挑战。

相较之下，利用小干扰RNA（siRNA）进行基因表达下调是一种较安全的方法，它可以有效降低耐药病毒的产生风险，并已被研究用于多种疾病的治疗。siRNA治疗最近在FDA批准的市场上针对一些疾病进行了商业化应用。siRNA通过与特定蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体（RISC），进而结合并降解目标RNA，从而抑制基因表达。

siRNA在治疗上优于单克隆抗体和小分子药物，因为它能更精确地针对基因表达，而不需要区分蛋白质复杂的三维结构。siRNA的设计对于其治疗应用至关重要，因为siRNA序列中的微小变化都可能影响其效果并带来非特异性效应。

为了设计出高效的siRNA，研究者考虑了包括目标可及性、基因组序列保守性、siRNA热力学特性、稳定性和免疫刺激性等多个关键因素。本研究中，研究团队提出了一个综合考量所有必要参数的siRNA筛选系统，特别强调了siRNA与Argonaute蛋白（AGO2）的功能域（PAZ和PIWI）之间的分子对接模拟在筛选高效siRNA中的关键作用。

通过这一系统，研究团队设计并筛选了约50个针对HIV-1 vpr基因的潜在siRNA，并通过在RAW 264.7巨噬细胞稳定细胞系中的实验验证了它们的细胞毒性和基因沉默效率。此外，本研究还探讨了结构建模和分子对接分析在识别高效siRNA中的应用，并通过计算机辅助突变分析研究了AGO2蛋白中特定残基对RNA稳定性的影响。

最终，研究团队在表达HIV-1 Vpr的RAW 264.7巨噬细胞中评估了选定siRNA的效果，为siRNA治疗策略提供了有价值的见解。

研究结果

siRNA的设计和筛选：研究者开发了一个改良的siRNA筛选系统，利用计算生物学工具对针对HIV-1 vpr基因的潜在siRNA进行了设计和筛选。

分子对接研究：通过分子对接研究，分析了siRNA与AGO2蛋白（RISC复合体的关键酶）之间的相互作用，这是诱发RNAi介导的基因沉默所必需的。

siRNA的细胞毒性评估：对选定的siRNA在RAW 264.7细胞中的细胞毒性进行了评估，发现在一定浓度下，siRNA对细胞的毒性很低。

基因沉默效率：通过qRT-PCR和流式细胞术分析，评估了siRNA在转录和翻译水平上对HIV-1 vpr基因表达的抑制效果，结果显示siRNA能显著降低HIV-1 vpr基因的表达。

siRNA的疗效比较：将通过分子对接分析筛选出的高效siRNA与作为对照的其他siRNA进行了疗效比较，发现分子对接分析有助于识别出更具基因沉默效果的siRNA。

siRNA的稳定性和功能域作用：通过计算机辅助突变分析，研究了AGO2蛋白中特定氨基酸残基对siRNA稳定性的影响，并探讨了PIWI功能域中氨基酸的作用。

总结：研究结果验证了所提出的siRNA筛选系统的稳健性，并展示了该系统在优化siRNA靶向和避免病毒耐药突变方面的潜力。

研究结论

本研究基于以往的研究成果和当前的实验数据，证实了研究团队开发的siRNA评分系统在针对HIV的靶细胞，如淋巴细胞和巨噬细胞中具有很高的可靠性。该系统能够识别目标基因的保守序列，优化siRNA的靶向性，并防止病毒通过突变产生耐药性。

自从siRNA被发现可以用于治疗以来，已经过去了二十年的时间，siRNA治疗技术最近已经获得了美国食品药品监督管理局（FDA）对一些疾病的治疗批准。研究团队期待本研究的发现能够促进开发出针对包括HIV-1在内的多种突变病毒的新治疗策略。目前，研究团队正在对这些siRNA在HIV感染的靶细胞中的效果和安全性进行评估。