研究发现：NK细胞联合细胞因子治疗或是艾滋治愈新方法

文章原名为“半同系NK细胞加白细胞介素2或N-803在HIV感染中的安全性和病毒学影响”作者为Jeffrey S Miller等人。文章2024年1月11日发布在《The Journal of Infectious Diseases》上，这是一本国际知名的、同行评审的医学期刊，专注于传染病领域的研究。

这项研究探索了向接受稳定抗HIV治疗的HIV感染者（PWH）输注半同系NK细胞以及配合IL-2或N-803细胞因子治疗的安全性和耐受性。虽然样本量小，但研究显示在部分参与者中HIV病毒RNA（vRNA）阳性细胞数量显著减少，证明了NK细胞在控制HIV方面的潜力。

研究还指出，未来研究需要更多地评估病毒储藏库，并确保有足够的细胞进行功能性评估。由于研究人群局限于白人男性，因此其结论的普遍性受限。尽管研究存在局限，但提供了NK细胞在HIV治疗策略中可能作用的初步证据。

背景：在慢性 HIV 感染中，自然杀手细胞（NK 细胞）的功能受损，无法有效清除病毒。我们认为，通过输注 NK 细胞并辅以白细胞介素2（IL-2）或 IL-15，有可能降低淋巴组织中产生病毒的细胞数量。

方法：我们对 6 名 HIV 感染者进行了一期初步研究，他们接受了一次来自半同系亲属的 NK 细胞输注，并辅以 IL-2 或 N-803（一种强效的 IL-15 超级激动剂）。

结果：这种治疗方法被证明是安全的，没有引起任何未预见的副作用。考虑到接受稳定抗病毒治疗的 HIV 感染者在淋巴组织中 T 细胞已减少，我们没有采用药物预处理来为新细胞“腾出空间”。研究发现，输注的供体细胞在血液中最多存活 8 天，在淋巴结和直肠中则可存活达 28 天。淋巴结中病毒 RNA 阳性细胞数量有中度降低。

结论：在淋巴结中，HIV 产生细胞数量中等程度减少。进一步的研究是必要的，以确定健康 NK 细胞对 HIV 储藏库的影响，以及是否可以将恢复 NK 细胞功能作为 HIV 治愈策略的一部分。

临床试验注册号：NCT03346499 和 NCT03899480。

在HIV最初感染时，它会在身体组织内建立一个由大量带有“沉默”HIV前病毒的CD4 T细胞组成的储藏库，这些细胞被认为是通过身体细胞的自我更新机制得以长期存在。然而，即便在接受抗病毒治疗（ART）的情况下，HIV仍能通过持续在淋巴系统和胃肠道等“避风港”中的病毒复制来维持这些储藏库。理想的治疗HIV策略应旨在清除既有潜伏的也有积极复制病毒的细胞。

自然杀手细胞（NK细胞）是先天免疫系统中极为关键的一部分，它们有潜力被用于清除HIV储藏库的两种形态。NK细胞能够发挥强大的抗癌和抗病毒效应，并在免疫监控中发挥重要作用。但是，在HIV感染的情况下，NK细胞的活动由于HIV对被感染细胞表面的MHC-I分子进行特定的修改而受到抑制。

HIV通过Nef和Vpu蛋白分别降低HLA-A、B、E和部分HLA-C的表达，这降低了被感染细胞被病毒特异性T细胞识别的可能性。同时，保留的HLA-C和HLA-E的表达又削弱了NK细胞的反应，这些细胞通过KIR2DL1/2/3和CD94/NKG2A这些抑制性受体来识别它们。因此，在HIV感染者中，NK细胞功能受损，失去了对抗病毒的一个重要防御机制。

在癌症治疗中，提高NK细胞功能的多种方法已经被探索，尤其是利用异体活性NK细胞对抗白血病的策略。我们的研究团队首次证明，通过在接受高剂量的环磷酰胺和氟达拉滨进行淋巴细胞减少处理后，从相关捐献者那里获取的半相合的异基因NK细胞能够在体内大量增殖，并在受体中持续存在超过14天。

在此之前，白细胞介素2（IL-2）是支持体内异基因淋巴细胞的唯一已知细胞因子。IL-2已被用于癌症治疗多年，并且在HIV感染者（PWH）的两项大规模试验中进行了研究，以评估其是否能通过增加CD4 T细胞数量和减少机会性感染来提供临床益处。然而，IL-15是另一种细胞因子，它有望通过直接作用于NK细胞以及CD4和CD8 T细胞来延长淋巴细胞的活动，IL-15不仅在生理上促进NK细胞和CD8 T细胞的功能，在体外还能激活HIV感染的CD4 T细胞，使其产生病毒基因，从而成为NK细胞攻击的目标。在接受淋巴细胞减少处理和单次NK细胞输注的患者中，有多达40%的患者实现了疾病的持久缓解。我们进行了一项对稳定接受ART治疗的HIV感染者输注半同系NK细胞的研究，这些NK细胞由IL-2（阿尔德司肽）或N-803（一种强效的IL-15超级激动剂，由ImmunityBio提供）来支持。

研究的设计与地点

本研究在位于明尼阿波利斯的明尼苏达大学进行。首位参与者于2017年10月16日加入研究，而最后一位参与者则于2020年2月13日加入。参与本研究的条件包括年龄介于18至65岁之间，至少连续12个月接受稳定的抗反转录病毒治疗（ART），在过去至少6个月的时间里，血浆中HIV RNA的水平低于检测阈值，并且最近的CD4 T细胞数量超过500细胞/µL。不符合参与条件的情况包括存在其他活动性感染（如丙型肝炎），怀孕或正在哺乳，以及有重要临床意义的心脏、肺、肝或肾疾病。

筛选流程

我们依据国家健康研究院艾滋病部门制定的不良事件（AE）评分系统（2.0版本）进行了筛选，所有筛选实验室检查（比如，完全血细胞计数和生化检查）的结果必须是正常的，或在这个评分系统上的毒性等级不超过1级。筛选的其他程序还包括通过胸前途径的心脏超声检查，显示肺动脉压力在18至26 mmHg之间，以及肺功能测试，显示第一秒的强制呼气量（FEV1）和对一氧化碳的扩散能力均大于预测值的50%。

参与者的程序

白细胞分离程序在MHealth诊所和手术中心完成。结肠镜检查及其活组织检查在明尼苏达大学医学中心（UMMC）的内窥镜中心进行。经验丰富的外科医生（J.C. 和 G.B.）在明尼苏达大学第一阶段临床研究单元（CRU）进行了腹股沟淋巴结的切除活检，这在基线和输注后的时间点完成。参与者被安排入住UMMC接受NK细胞输注、首剂细胞因子，并进行输注后24小时的观察。所有随后的访问均在CRU进行。

IL-2和N-803的剂量给药

给予2名参与者在NK细胞输注4小时后通过皮下注射600万单位的IL-2（第0天），并在第2、4、6、8、10天重复给药（见图1）。每次门诊给药后，参与者在临床研究单元（CRU）中被观察长达4小时。N-803则在NK细胞输注4小时后以每公斤体重6微克的剂量皮下给药（第0天），并在第21天与第42天分别再次给药。

有关捐献者NK细胞采集、外周血单核细胞（PBMC）的处理、血浆HIV RNA检测和用流式细胞术测定特定淋巴细胞亚群的具体细节，可以在补充资料中找到。同时，关于原位杂交（ISH）、免疫组织化学（IHC）和定量图像分析（QIA）的方法也已广泛发表，其详细内容同样收录在补充资料中。

统计分析

我们使用非配对t检验来比较淋巴结中CD56+细胞（即NK细胞）的频率与小肠或直肠中的频率。鉴于样本量较小，我们未进行病毒RNA（vRNA）阳性细胞频率的统计学比较。

研究审批

本研究分析的所有样本都是在获得参与者书面同意的前提下，按照经机构审查委员会批准的协议（代码1508M77601和00003157）收集的。本研究协议已得到美国食品和药物管理局（FDA，IND编号16486）的批准，并已在ClinicalTrials.gov上注册（NCT03346499用于IL-2研究，NCT03899480用于N-803研究）。参与者通过他们的主治医生的推荐、社交媒体广告和印刷媒体进行招募。

协议概述

这项在单个研究中心进行的研究主要旨在评估在接受有效的抗反转录病毒治疗（ART）的HIV感染者（PWH）中，采用半同系NK细胞转移治疗的安全性。最初，我们计划招募5位参与者接受NK细胞加IL-2的治疗。

然而，在首两位参与者完成研究程序后不久，N-803可供使用，我们据此修改了研究协议，决定采用N-803替代IL-2，并额外招募了4位参与者。基于我们之前对HIV感染者进行的剂量逐步增加研究，我们选择了每3周一次共3次的给药频率，剂量为每公斤体重6微克皮下注射。次要研究目标是观察淋巴组织中携带病毒RNA的细胞频率是否有所降低。

参与者详情

本研究共征得19名个体的同意并对其进行了筛选，其中12人符合条件并完成了研究协议，包括6名捐献者和6名接受者。未通过筛选的主要原因是找不到合适的半同系捐献者，因为一些接受者有与之HLA完全匹配的兄弟姐妹捐献者。

在进行NK细胞输注之前，参与者接受了腹股沟淋巴结的基线活检以及对小肠、大肠和直肠的结肠镜检查和活检。这些检查在输注后的各个时间点再次进行（见图1）。有两位参与者（一位接受IL-2治疗，另一位接受N-803治疗）没有完成两次淋巴结活检。研究组成员的人口统计学及临床特征在表1中展示。所有参与者均为白人男性。

相关捐献者NK细胞制品

捐献者的NK细胞在6个抗原I类位点上的HLA匹配程度不同，范围在3到4个位点之间，这是通过高分辨率的分型技术确定的（见补充表1）。更多的结果在补充材料中展示。

主要研究结果分析

安全性与耐受性

参与者良好地耐受了所有程序，包括NK细胞和药物输注，其中6名参与者中未观察到任何意外的安全风险（参见表2）。在6名进行了白细胞分离以提取NK细胞的捐献者中，没有报告任何不良事件。

在接受IL-2治疗的两名参与者中，最常见的临床不良反应包括注射部位出现红斑和硬化。与IL-2治疗相关的其他临床不良反应包括两位参与者出现发热和疲劳，以及一位参与者出现肌肉疼痛和寒颤。有一位参与者报告了与淋巴结活检相关的疼痛感。没有出现高于2级的不良反应（参见表2），这与之前关于在HIV感染者中使用IL-2的研究结果相符。

对于接受N-803治疗的四名参与者，不良反应的情况与之前的研究报告的相似。大部分不良反应为1级，既包括局部反应也包括全身反应。没有观察到或报告与细胞因子释放综合症或移植物对宿主病相关的任何迹象或症状，这些通常与细胞因子或NK细胞输注治疗有关。

在两个研究分组中，大部分的实验室检测不良事件（见表2）均为1级。有两例报告的3级副作用：一名接受IL-2治疗的参与者出现了估计的肾小球滤过率降低，而一名接受N-803治疗的参与者的绝对淋巴细胞计数（ALC）降低。

这个3级的低ALC是在接受第一剂N-803后两天进行的血液检测中发现的，持续时间大约为2天。两天后进行了另一次检测，此时的ALC数值对应于一个2级的不良事件。随后，在上次抽血后的第三天进行的第三次检测结果显示正常。

次级研究结果分析

外周血T细胞和NK细胞数量的变化

IL-2或N-803的应用与T细胞及NK细胞的激活和增殖有关。我们在NK细胞输注后的若干个时间点上测量了外周血中NK细胞以及CD4和CD8 T细胞的数量，并对其频率随时间的变化进行了图示（图2A-C）。在NK细胞输注及细胞因子治疗开始之后，CD4 T细胞、CD8 T细胞和NK细胞的数量会立即下降，到达第7天时反弹至超过基线的水平，并在第21天返回到正常水平。在接受IL-2治疗的参与者中，这三种细胞类型的总体增加趋势似乎更为显著。

我们很想了解细胞因子或NK细胞疗法是否会影响肠道或淋巴结组织中NK细胞数量的变化。为此，我们采用了免疫组织化学（IHC）和定量图像分析（QIA）技术，来检测淋巴结和肠道活检样本中CD56阳性NK细胞的频率。在图3A至C中，我们展示了淋巴结、回肠和直肠切片使用抗CD56抗体染色的样本，这种标记用于识别NK细胞。

通过QIA技术，我们评估了这些组织中CD56阳性细胞的比例。虽然CD56标记可以识别NK细胞，但它也能标记一小部分CD3阳性细胞。理论上，使用抗体的免疫荧光法对CD56阳性和CD3阴性细胞进行计数会更精确，但由于技术上的限制，我们无法实施这一方法。

治疗前后CD56阳性细胞频率的比较，并未在淋巴结、回肠和直肠中发现明显差异。不过，值得注意的是，后续的活检总是在最后一次细胞因子治疗几天后进行的，这可能导致我们漏检了由于IL-2或N-803治疗而引发的组织中T细胞或NK细胞暂时性的变化。我们确实观察到淋巴结与回肠或直肠中CD56阳性细胞频率之间存在显著差异（如图3D所示）。

输注NK细胞的持续存在性

在利用半同系NK细胞来治疗难治的白血病或实体肿瘤时，常规方法是通过使用环磷酰胺对患者进行预处理，目的是为输注的细胞在免疫系统中“腾出空间”。临床研究证明，这种做法能够使供体细胞在接受者的外周血中存在时间更长。

鉴于环磷酰胺和氟达拉滨预处理所伴随的毒副作用，以及长期接受抗反转录病毒治疗（ART）的HIV感染者在淋巴组织中已经存在的T细胞显著减少（也就是说，他们的免疫系统中已经“腾出了空间”），我们决定不采取这种预处理策略。

在针对血液恶性肿瘤治疗的场景下，通过嵌合体研究（即在接受者体内识别供体细胞）发现，如果不进行淋巴细胞耗竭的预处理，供体细胞在接受者体内的持续时间仅为24到48小时；而进行高剂量的淋巴细胞耗竭预处理后，供体细胞在接受者体内的存在时间可以延长至一个月。

我们研究了两位参与者，一位接受了NK细胞加IL-2治疗，另一位接受了NK细胞加N-803治疗，通过利用能够识别供体和受体细胞之间差异的HLA抗体，来测量外周血中供体细胞的频率。图4A展示了一位接受IL-2治疗的参与者（2474）的情况，其HLA B7阳性细胞在输注后第8天仍能在外周血单核细胞中检测到。

对于接受N-803治疗的参与者（2611），供体细胞为HLA Bw6阳性，通过流式细胞术至少在输注后第6天检测到了一定数量的细胞（后续因细胞数量不足而无法进行进一步时间点的检测）。此外，我们还采用免疫组织化学方法检查了参与者2474在NK细胞输注21天后获取的淋巴结和肠道组织样本，在输注后28天时，这些组织中依然能够检测到HLA B7阳性细胞（如图4B和4C所示）。

在PBMCs和LNs中病毒储藏库的测量

在对PBMCs（外周血单个核细胞）和LNs（淋巴结）进行的病毒储备测量中，N-803组的参与者在研究开始时以及接下来的第2、4、7、10、14、21、42和49天进行了血浆HIV RNA水平的测量，此后在第二次活组织检查后的第2、4、6和8周又进行了测量。

IL-2组的情况类似，其血浆HIV RNA水平在研究开始时和之后的若干特定天数进行了测量，以及在第二次活组织检查后的几个周次再次进行了测量。所有参与者在研究开始时的血浆HIV RNA水平均未检测到。在N-803组中，我们在4位参与者中的2位观察到每次使用N-803后血浆HIV RNA水平的轻微上升。

通常情况下，血浆中的HIV RNA从未检测到状态变为可检测状态，但水平保持在20副本/mL以下。但是，在首次用药后的第七天，有两位参与者分别检测到了20和26副本/mL的HIV RNA水平。在接受IL-2治疗的一位参与者中，血浆中的HIV RNA也被间歇性地检测到，但所有的测量值都低于20副本/mL。

我们接下来对淋巴组织中的vRNA阳性细胞和vDNA阳性细胞进行了频率测量，采用的是HIV RNA和DNA的原位杂交技术（分别为RNAscope和DNAscope，由ACD Bio提供）。在先前的研究中，我们发现，在接受稳定的抗HIV治疗并且血浆中HIV RNA不可检测的人群中，淋巴结里的vRNA阳性细胞频率通常介于每克淋巴结1.5 × 10^4至1 × 10^5细胞之间。这大约等同于每1 × 10^6个CD4 T细胞中有70到100个vRNA阳性细胞。

我们对来自淋巴结、回肠和直肠的组织样本进行了切片，每个样本制备了多个5微米厚的切片，并对其中5到10片进行了ISH分析，这些切片之间至少间隔20微米，从而对100到200微米厚的组织进行了采样。这种用于计数vRNA阳性细胞的方法已通过我们及其他实验室的广泛验证。正如前所述，我们从4位参与者那里获取了治疗前后的淋巴结样本。

另外两位参与者仅在两个时间点之一提供了淋巴结样本。在基线阶段获取的5个淋巴结样本中，我们均检测到了vRNA阳性细胞，平均频率为每克淋巴结组织1.2 × 10^5细胞。而在IL-2或N-803治疗后的第21天或第49天获取的5个淋巴结样本中，平均频率降至每克淋巴结组织7.1 × 10^4细胞。尽管没有进行详细的统计分析，但我们观察到，在提供了治疗前后样本的4位参与者中，淋巴结中vRNA阳性细胞频率明显下降。

我们还采用DNAscope ISH技术测量了淋巴结中的vDNA阳性细胞频率。与vRNA阳性细胞数量减少不同，我们没有观察到HIV DNA阳性细胞数量的一致减少，这表明即使部分带有缺陷前病毒的细胞数量增加，但同时也有制造HIV病毒粒子的细胞被消除。NK细胞输注前后，HIV DNA阳性细胞的平均频率分别为每克1.7 × 10^6细胞和1.3 × 10^6细胞。

我们还能够检查在与淋巴结活检同时获得的4位个体的直肠和回肠组织。我们发现，在治疗前，回肠中vRNA阳性细胞的平均频率为7.5 × 10^4细胞/克组织（范围，0–1.7 × 10^5细胞/克），治疗后为5.6 × 10^3细胞/克组织（范围，0–1.7 × 10^4细胞/克）。在直肠中，治疗前vRNA阳性细胞的平均频率为1.6 × 10^4细胞/克组织（范围，0–1.7 × 10^4细胞/克），治疗后为5.3 × 10^3细胞/克组织（范围，0–1.7 × 10^4细胞/克）。因此，有一些证据表明胃肠道组织中的vRNA阳性细胞也有所减少。

在这项初步的第1期试验中，我们的核心目标是评估向接受稳定抗HIV治疗且血浆中无法检测到病毒的HIV感染者输注半同系NK细胞的安全性及其耐受程度。我们观察到，由于IL-2和N-803引起的预期不良反应都可以轻松处理。大体上，报告的大部分临床和实验室不良反应均为轻微级别（1级）。因此，我们得出结论，根据本协议进行的半同系NK细胞输注及随后的细胞因子治疗是安全且被良好耐受的，与N-803相关的预期不良反应在5至7天内均可自行缓解。

我们在最后一次细胞因子治疗前后一周测量了组织内CD56阳性细胞的频率，旨在探究由于细胞因子诱导的激活作用，这些组织中NK细胞总体是否有所增加。我们并未观察到从治疗前到治疗后细胞数目的显著变化。但是，考虑到我们是在最后一次输注至少一周后才收集这些样本，如果组织中出现了瞬时NK细胞增加，采用这种方法可能会漏掉这一发现。

这一点在回肠和直肠的样本中也得到了验证，尽管这些组织中的细胞总数明显低于淋巴结。我们还特别关注，即使没有采用环磷酰胺和氟达拉滨这类药物预处理来创造“免疫空间”（这是治疗血液癌症患者的常规做法），这些细胞是否能够持续存在。通过流式细胞术进行的嵌合体研究显示，在3位参与者中，基于HLA差异识别的供体细胞至少可以持续6到8天，甚至更长时间，但我们缺少更多样本来验证后续时间点。这与接受淋巴消耗性化疗的癌症患者的情况相似。

此外，我们通过免疫组织化学技术发现，在接受IL-2治疗的一位参与者身上，输注NK细胞后第28天，在直肠和淋巴结组织中都能检测到供体细胞的存在。据我们所知，这是首次研究NK细胞在淋巴组织中的持久性，我们意外发现，即使在没有进行淋巴消耗处理的情况下，这些细胞也能至少持续生存一个月。

在本研究中，我们无法确切判断是NK细胞本身还是额外添加的细胞因子对于减少HIV病毒储藏库的作用，因为这两者之间存在相互依赖的关系。但是，基于异种移植的小鼠模型中进行的人NK细胞移植实验表明，如果没有细胞因子的支持，NK细胞在体内的存在将只是暂时的。

然而，与IL-2或IL-15共同输注可以使NK细胞在体内持续存活超过一个月。这正是为什么在NK细胞输注时需要配合细胞因子一起使用（正如我们的研究所做的），或者通过NK细胞的遗传工程改造来内置细胞因子信号，这是其他研究正在探索的方向。要明确仅使用细胞因子与结合NK细胞使用细胞因子在减少病毒储存方面的差异，还需要进行更大规模样本的进一步研究。

值得注意的是，有几项研究指出，使用IL-15刺激NK细胞可以加强抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）。虽然这还需进一步探索，但这暗示了IL-15、NK细胞以及HIV广泛中和抗体的结合使用可能会增强ADCC效应，从而更有效地减少HIV病毒储藏库。

我们还发现淋巴结中vRNA阳性细胞的频率显著降低，在肠道组织中也有类似的减少，但鉴于研究参与者数量有限，没有提供统计分析。这些数据表明，提供功能性NK细胞可能成为治愈HIV成功策略的一部分。尽管考虑到全球数百万HIV感染者（PWH），用半同系NK细胞输注的规模不切实际，但这种方法确实为这些细胞在控制HIV中的潜在作用提供了原理证明。

目前，几家公司正在研究NK细胞在血液和实体器官恶性肿瘤中的具体抗肿瘤效果。这些细胞是商业生产的，并以简单的剂量包形式提供，这些剂量包保持冷冻直至输注，不需要特殊设备或处理，这使得这种方法可以扩展。

这项研究存在局限性。研究人群不够多样化，因为研究对象仅限于白人男性。此外，由于这是一项小样本量的安全性研究，没有足够的能力完全确定干预的病毒学影响，我们无法为所有结果提供统计比较。

尽管存在研究限制，我们通过HIV RNA原位杂交技术（ISH）观察到淋巴结中vRNA阳性细胞显著减少。不幸的是，我们没有从组织活检中获得足够的细胞来完成确认性分析（例如，完整前病毒DNA检测或超敏P24测量）。未来的研究应优先考虑对病毒储藏库的额外评估，并确保有足够的细胞可用于全面评估NK细胞的功能能力。

注释：

PWH：People With HIV，指HIV感染者。

ART：Antiretroviral Therapy，指抗逆转录病毒治疗，是HIV/AIDS的一种治疗方法。

IL-2：Interleukin 2，一种免疫系统调节蛋白，用于某些治疗中。

NK细胞：Natural Killer Cell，自然杀手细胞，是人体免疫系统中的一种细胞，能够识别并杀死某些感染的细胞和肿瘤细胞。

vRNA：Viral RNA，病毒RNA，指HIV等病毒的遗传物质。

vDNA：Viral DNA，病毒DNA，指通过某些过程，如逆转录，由病毒RNA转化而来的DNA。

LN：Lymph Node，淋巴结，是人体免疫系统的重要组成部分。

ISH：In Situ Hybridization，原位杂交，一种用于检测特定DNA或RNA序列的实验技术。

FITC：Fluorescein Isothiocyanate，荧光素异硫氰酸酯，一种荧光标记物，用于细胞和分子生物学实验。

PE：Phycoerythrin，藻红蛋白，另一种常用的荧光标记物。