加拿大研发新型纳米凝胶，通过阴道给药的方式防治HIV

文章原名为“pH敏感的基于siRNA的双重预防性纳米杀微生物剂在阴道CD4+细胞中重新激活自噬并抑制HIV感染”，作者为杨思迪（音译）等人 。文章2024年2月6日在《Journal of Controlled Release》杂志上发布，其电子版可以访问Science Direct。

本文深入探讨了通过使用siRNA纳米颗粒（NP）和特制凝胶剂型在阴道途径上防治HIV的创新方法，同时强调了激活自噬细胞这一关键机制在抗击HIV中的作用。通过调节动物模型的生理环境、精细设计纳米颗粒的物理化学特性，并针对性地激活自噬过程，研究成功展示了这种方法在提高阴道内siRNA传递效率和促进细胞自我清理HIV病毒的潜力。

实验结果证明，这种配方不仅能有效穿透阴道粘液屏障，还能增加HIV目标细胞对治疗成分的吸收，同时通过激活自噬过程，为细胞提供了额外的防御机制，显示出在预防和治疗HIV方面的显著效果。此项工作为利用阴道途径对抗HIV提供了一个新的视角，并突出了自噬激活在未来性传播感染病防治中的重要角色，为未来的研究和应用开辟了新道路。

研究表明，由于生理和社会因素，女性通过未采取保护措施的异性性行为感染HIV的几率更高。为了应对这一问题，科学家们利用针对HIV病毒和宿主细胞基因的小干扰RNA（siRNA）进行阴道内给药，这种方法在对抗单纯疱疹病毒（HSV）、人乳头瘤病毒（HPV）和HIV方面显示出了前景。

本次研究中，我们开发了一种新型pH敏感的纳米微生物杀手，通过结合使用针对宿主CCR5基因和病毒Nef基因的siRNA，旨在预防或减少HIV通过阴道传播。这种纳米微生物杀手利用PLGA-PEG纳米颗粒包裹siRNA，并配制成HEC凝胶形式，通过精确靶向，既可以阻止HIV进入和感染细胞，也可以通过激活通常被HIV病毒Nef基因抑制的自噬作用，帮助清除细胞内的病毒。

在实验中，这种纳米颗粒能够根据阴道内的pH值智能调控siRNA的释放，确保在适当的环境中释放更多的siRNA，从而提高效果。它在体外实验中显著降低了CCR5和Nef蛋白的表达，强化了细胞清除HIV的能力，并在阴道模型中展示了优秀的安全性和效能。此外，通过特定的抗体修改，这种纳米微生物杀手在动物模型中的分布更加精确，避免了对身体其他部分的不良影响，证明了它作为防止HIV阴道传播的潜在有效手段。

RNA干扰技术（简称RNAi）是一种在细胞内部通过特定小片段的RNA（称为siRNA）来“静默”特定基因的活动的过程。这些siRNA片段能够精确匹配并关闭它们的目标基因。研究表明，通过阴道使用含siRNA的微生物杀手，能有效预防像HIV、单纯疱疹病毒2型（HSV2）和人乳头瘤病毒（HPV）这样的性传播疾病。通过针对一个或多个与病毒生命周期相关的关键因素，这些治疗性siRNA能够阻止病毒复制和形成有效感染。同时，通过锁定病毒进入细胞所需的宿主基因，可以在病毒试图入侵之前就阻止它，从而预防感染。

将针对病毒和宿主基因的siRNA结合使用，能够进一步增强防病毒效果。阴道微生物杀手的设计目的是在感染的初始位置发挥作用，同时减少对全身的副作用。但是，如果直接将裸露的siRNA施用到阴道，它们很容易被迅速分解，难以有效进入细胞，也难以从细胞的内体中逃逸。因此，开发能够帮助siRNA顺利穿越细胞内外障碍、精准送达目标位置的药物传输系统变得尤为关键。到目前为止，已有一些成功的研究通过使用纳米颗粒作为载体，实现了siRNA在阴道内的有效传递，进而在实验室和动物实验中抑制了HIV、HSV和HPV的活动。

HIV为了侵入宿主细胞，需要利用CD4受体以及共受体CCR5或CXCR4。在HIV最初开始感染时，CCR5扮演着主要的角色，而在疾病的后期，CXCR4的作用变得更加重要。研究显示，人体的宫颈阴道组织更容易被R5类型的HIV-1病毒感染，而不是X4类型。因此，CCR5成为了防止HIV通过阴道感染的关键共受体目标。有趣的是，那些基因中带有CCR5 delta32变异（这是一个CCR5基因中有32个碱基对缺失的变体）的人，天生对HIV-1具有抵抗力，而且他们的免疫系统没有明显的缺陷。

HIV中的一个辅助蛋白质，称为负调节因子（Nef），在HIV的生产中也起着关键作用。研究发现，感染了缺乏Nef的HIV-1病毒株的患者，要么完全不会发展成艾滋病，要么进展到艾滋病的速度远慢于感染了正常病毒株的患者。这可能与Nef的几个生物学作用有关，包括帮助病毒感染的细胞避免被免疫细胞识别、诱导未感染的T细胞死亡，以及抑制巨噬细胞中的自噬过程。

自噬是细胞在面临压力时，用来分解和回收老化蛋白质和损坏细胞器的一种自我清理过程，它在清除体内的病原体（比如病毒和细菌）中起着至关重要的作用。Nef通过阻断自噬过程的最后阶段，妨碍宿主细胞利用自噬来清除体内的HIV。然而，如果从HIV的遗传物质中去除Nef，宿主细胞就能够重新通过自噬来清除HIV。

因此，同时使用针对CCR5和Nef的siRNA作为防止HIV通过阴道传播的双管齐下策略是可行的。降低CCR5的活性可以阻止病毒侵入细胞，这相当于设置了一个抵御HIV的初级防线。同时，抑制Nef不仅可以减轻病毒引起的病害，还能恢复原本被Nef阻断的自噬过程，帮助细胞清除入侵的病毒，这则构成了一个进一步保护细胞免遭HIV感染的次级防御体系。

自噬是细胞的一种自我清理过程，通过这个过程，细胞可以分解蛋白质、细胞器和入侵的微生物，从而保护自身。自噬主要有三种形式：大自噬、小自噬和伴侣蛋白介导的自噬。在大自噬和小自噬中，细胞分别通过包裹的方式将大型物质送入溶酶体进行分解，而伴侣蛋白介导的自噬则专门分解特定的可溶性蛋白质。大自噬尤其重要，因为它帮助细胞抵御微生物侵害。大自噬开始时，细胞膜会形成一个叫做食胞体的结构，它会捕捉要分解的物质，并最终形成双层膜囊泡——自噬体。自噬体之后与溶酶体融合，形成自溶体，其中的物质被分解为氨基酸、脂肪酸和核酸，以供细胞再利用。

在这个过程中，一些关键的调节蛋白，如beclin-1和VPS34，会在食胞体形成时被激活生产。随后，LC3B蛋白从其前体LC3A转化而来，并随着自噬体的形成而附着在其上。在自噬体与溶酶体融合形成自溶体的过程中，会产生更多的调节蛋白，如TECPR-1和UVRAG。随着分解过程的进行，LC3B和其他物质一起被分解，完成了自噬过程。

利用传统的制作方法高效地将siRNA包裹进PLGA纳米颗粒（NP）内是一项挑战，原因在于siRNA的分子量较低，容易在制备过程中从一个水相层泄漏到另一个。此外，siRNA的亲水性和它那带负电的磷酸盐基团与PLGA的负电荷酸基团之间的静电排斥作用，使得它们难以紧密结合。不过，使用聚乙烯亚胺（PEI），一种正电荷的高分子物质，可以有效地通过静电作用将siRNA紧密包裹，将其低分子量的siRNA转换为高分子量的复合物，这样就大大提高了siRNA被纳米颗粒载体封装的效率。

在这项研究中，我们首次展示了一种在CD4+细胞中通过pH敏感方式释放siRNA的方法，这种方法通过靶向CCR5和Nef基因来抑制HIV的进入，并激活自噬过程以对抗HIV感染。

2.1. 材料

我们从加拿大安大略省的Thermo Fisher购买了Scramble siRNA和Cy-3 scramble siRNA。用于靶向CCR5和Nef的PCR引物和siRNA则是从Dharmacon和Thermo Fisher购得，具体序列可以在补充资料的表格1中找到。我们还从Millipore-Sigma购买了分子量为25 KDa的分支型PEI、31-50 KDa的聚乙烯醇（PVA）和香豆素-6。50/50比例、分子量为10 KDa的PLGA-PEG（末端带有羧酸基团）是由加拿大魁北克省的Advanced Polymer Materials合成的。

HEC（Natrosol™ 250 HX PHARM）是由美国佐治亚州的Ashland公司慷慨提供的。甘油和磷酸二钾是从Fisher Scientific购买的。乙酸乙酯和氯仿是从EMD公司购买的。用于过滤的MF-Millipore膜（混合纤维素酯制，亲水性，孔径5.0微米）是从Millipore购买的。用于细胞增殖测试的CellTiter 96® AQueous One Solution（MTS）是从Promega购买的。E.Z.N.A.® RNA分离试剂盒是从Omega Bio-Tek购买的。

用于检测自噬的CYTO-ID®试剂盒是从Enzo Life Sciences购得。用于蛋白质测定的Pierce™ BCA试剂盒、无蛋白质阻断缓冲液、带生物素的抗ER抗体等实验材料是从Thermo Fisher购买的。TNF-α、IL1-β、IL-6、IL-8等炎症因子的ELISA试剂盒和其他相关试剂是从R&D Systems购买的。针对LC3B、HIV1 Nef等的抗体是从Abcam购买的。用于细胞染色和阻断实验的BD染色缓冲液、人BD Fc Block和抗CCR5抗体等是从BD Biosciences购得。用于cDNA合成和qRT-PCR实验的qScript™ cDNA和PerfeCTa SYBR Green SuperMix是从Quanta购买的。

2.2. 细胞培养

我们从美国国立卫生研究院（NIH）的试剂计划获得了Sup-T1细胞以及稳定表达Nef蛋白的Sup-T1细胞（这些细胞表达的是一种Nef蛋白和雌激素受体激素结合区域融合的特殊蛋白，简称Nef-ER）。VK2/E6E7细胞则是从美国弗吉尼亚州的ATCC公司购买的。我们使用的灭活FBS（胎牛血清）是从加拿大安大略省的PAA公司购买的，而RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素和pH值为7.4的PBS缓冲液则是从Lonza公司购得。角蛋白细胞特殊培养基（Keratinocyte-SFM）及其补充物是从Thermo Fisher Scientific公司购买的。氯化钙则是从Millipore-Sigma公司购得。

Sup-T1细胞在37摄氏度和5%的二氧化碳环境下培养，使用的是添加了10%灭活胎牛血清和青霉素-链霉素（浓度为100微克/毫升-100单位/毫升）的RPMI-1640培养基。表达Nef-ER蛋白的细胞也在同样的条件下培养，但培养基中额外添加了1.5微克/毫升的普洛霉素和20微摩尔的2-巯基乙醇，以维持基因的稳定表达。VK2/E6E7细胞同样在37摄氏度和5%二氧化碳的条件下培养，不过使用的是角蛋白细胞特殊培养基，这种培养基中添加了0.1纳克/毫升的人类重组表皮生长因子、0.05毫克/毫升的牛垂体提取物、44.1毫克/升的氯化钙和青霉素-链霉素。

2.3. 纳米颗粒制备

我们首先利用聚乙烯亚胺（PEI）将siRNA凝聚起来，接着通过双乳液蒸发法将其封装进纳米颗粒内，这一过程使用了可生物降解的PLGA-PEG二元共聚物。具体操作如下：将相同体积的siRNA（含量为25-100微克的150微升）和PEI（溶于150微升的TE缓冲液，pH值为7.5）混合，按照不同的氮磷比例（从0:1到6:1）在室温下孵育15分钟。

接着，通过在一个15%的聚丙烯酰胺凝胶中以90伏特，400毫安的电流运行130分钟，来确定完全凝聚siRNA的最佳氮磷比例。将siRNA-PEI复合物与溶于二氯甲烷的PLGA-PEG（浓度为10毫克/毫升）的600微升混合，并进行15秒的超声处理，形成初级乳液。然后，这个初级乳液被倒入4.3毫升的2%聚乙烯醇（PVA）溶液中，并再次进行3分钟的超声处理，形成一个双层水/油/水乳液。这个双乳液随后在4摄氏度下搅拌，通过去除有机溶剂来使其固化成固态纳米颗粒。

通过在4摄氏度下，20,000倍重力加速度离心15分钟，最后收集得到的纳米颗粒，并用水洗两次，去除未被封装的药物和多余的聚合物。使用相同的方法，还制备了封装了香豆素-6和siRNA（1.25%）的纳米颗粒（简称C6-siRNA NP）。在将PLGA-PEG溶解于二氯甲烷的步骤中，也添加了C6。

2.4. 制备含有纳米颗粒的阴道凝胶

我们准备了两种具有不同pH值（5.0和7.0）的羟乙基纤维素（HEC）凝胶。首先，将约1克的HEC（2%浓度，即现成的HEC凝胶）溶解在40毫升的磷酸二氢钠（NaH2PO4）溶液中，并在4摄氏度下调整其pH值至5.0或7.0。通过添加5克的甘油（占总重量的10%）来调节凝胶的粘度，并确保其均匀分布。

接着，将凝胶的pH值调整到5.0 ± 0.2或7.0 ± 0.2（符合阴道的生理pH值），并使用相应pH值的NaH2PO4溶液将总重量调整到50克。随后，将纳米颗粒（NPs）重新悬浮在相应pH值的NaH2PO4溶液中，并将其与之前准备的HEC凝胶按适当比例混合，然后在4摄氏度下搅拌2小时，制得含有纳米颗粒的1%或0.5%HEC凝胶。

2.5. 纳米颗粒的特性分析

2.5.1. 粒子大小和zeta电位

为了测定纳米颗粒的大小，我们将其在pH值为7.4的PBS（磷酸盐缓冲溶液）或pH值为4.2的阴道液模拟溶液（VFS）中以25微克/毫升的浓度重新悬浮，并利用ZetaPALS（Brookhaven Instruments公司的一种设备）进行了测量。VFS的配制方法如之前描述的那样。

简单来说，为了配制1升的VFS，我们使用了以下成分：氯化钠3.51克、氢氧化钾1.40克、氢氧化钙0.222克、牛血清白蛋白0.018克、乳酸2.00克、醋酸1.00克、甘油0.16克、尿素0.4克和葡萄糖5.0克。测量zeta电位时，以50微克/毫升的浓度将颗粒重新悬浮在同样的缓冲液中，并在smoluchowski模式下使用ZetaPALS进行了分析。

2.5.2. 纳米颗粒的封装效率

为了确定封装效率（EE%），我们使用上述方法将Cy-3标记的scramble siRNA封装进纳米颗粒中。封装效率是通过下面的公式计算的，将Cy-3标记的scramble siRNA溶解在未包含药物的纳米颗粒悬浮液中，作为标准曲线使用。

2.5.3. 从纳米颗粒中释放siRNA的过程

为了观察纳米颗粒释放siRNA的特性，我们将大约0.7毫克装载有Cy-3标记的scramble siRNA的纳米颗粒重新悬浮在1毫升的PBS（pH 7.4）或者VFS（pH 4.2）溶液中，并将其放在37摄氏度的旋转振荡器中孵育。在不同时间点，我们会将样本在4摄氏度下以20,000倍重力加速度离心15分钟，然后移除200微升的上清液并加入新鲜的培养基。

为了排除siRNA可能发生的降解影响，我们还将自由状态的siRNA重新悬浮在同一种释放培养基中，并同样进行取样分析。通过使用板读取器（Synergy HT, BioTek），在530 ± 25纳米的激发波长和590 ± 35纳米的发射波长下对siRNA进行定量分析。

2.5.4. 纳米颗粒在细胞内的摄取实验

我们在实验当天将Sup-T1细胞种植在24孔的组织培养板（由Corning公司，美国纽约州生产）上，每孔加入0.5毫升的培养基。随后，我们向Sup-T1细胞中添加了溶解在PBS中的Cy-3标记的scramble siRNA纳米颗粒，最终浓度设置为600微克/毫升，同时设置了不含siRNA的纳米颗粒作为对照组。

所有处理组都在37摄氏度和5%二氧化碳的环境中培养，并分别进行了2小时、6小时和24小时的处理。处理结束后，我们通过离心（100倍重力加速度，5分钟）收集细胞，用PBS洗涤两次，并最终使用流式细胞仪（Canto II, BD公司）进行了分析。

2.5.5. 在Nef-ER细胞中敲除CCR5和Nef基因

我们将针对CCR5和Nef的siRNA（每种50微克）按照第2.3节描述的方法共同封装到纳米颗粒中。在进行基因敲除的体外实验中，我们使用了之前建立好的Nef-ER细胞模型。这些Nef-ER细胞（大约80,000个）被播种在24孔板上，每孔添加450微升的培养基，并加入50微升不同浓度的纳米颗粒进行处理。

由于空间结构的限制，Nef-ER蛋白原本是不活跃的；我们通过同时添加4-羟基他莫昔芬（一种可以穿过细胞膜的药物），最终浓度设为5微摩尔，来诱导细胞内Nef蛋白的表达和活化。细胞在37摄氏度和5%二氧化碳的条件下孵育48小时或72小时。

为了评估mRNA水平的敲除效果，处理48小时后的细胞在室温下以200倍重力加速度离心5分钟，随后使用E.Z.N.A.® RNA分离试剂盒进行细胞裂解。提取的RNA被转换成cDNA，使用qScript™ cDNA SuperMix进行反转录，并在QuantStudio™ 6 Flex实时PCR系统上使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix进行定量分析。

为了了解蛋白表达量的变化，处理72小时后的细胞同样在室温下以200倍重力加速度离心5分钟进行收集。通过流式细胞仪测量CCR5蛋白的水平，而Nef蛋白的水平则通过ELISA测定。测量CCR5蛋白时，首先将细胞用2%的甲醛固定20分钟冷藏，之后用Human BD Fc Block在室温下洗涤和阻断10分钟。

之后，我们将细胞在冰上用特定的抗CCR5抗体标记了30分钟。接着，我们收集这些细胞，洗净它们，并用流式细胞技术进行了分析。为了检测Nef蛋白，我们首先采用了一个公开的方法来裂解细胞，以便提取其中的总蛋白。接下来，我们用Pierce™ BCA蛋白测定试剂盒来确定蛋白的量，并将其调整到最终浓度100微克/毫升，这个过程中使用了特定的ELISA试剂来稀释蛋白样本。

我们将ELISA板的每个孔都涂上了100微升含有抗Nef抗体的溶液（浓度为2微克/毫升），并让它在4摄氏度下过夜。随后，我们三次用洗涤液清洗板子，并用一种不含蛋白的阻断液覆盖了2小时来阻止非特异性结合。然后，我们向每个孔中添加了100微升的样本，并在室温下孵育了2小时。洗净孔后，我们添加了100微升的生物素标记的抗ER抗体（浓度为1.3微克/毫升），并再次在室温下孵育了2小时。

接下来，我们向每个孔中加入了稀释后的链霉亲和素-HRP，让它在室温下反应20分钟。随后，我们加入了100微升的显色底物，并让它在室温下反应10到20分钟以发展颜色。最后，我们加入了停止反应的溶液，并在450纳米的波长下读取了ELISA板的吸光度。

2.5.6. 在体外重新启动自噬过程

我们在24孔板上分别种植了Sup-T1和Nef-ER细胞，每孔大约有80,000个细胞，使用450微升的培养基。接着，我们向这些细胞中添加了含有纳米颗粒的悬浮液（50微升）和4-羟基他莫昔芬（4-HT），它们的最终浓度分别是1.3毫克/毫升和5微摩尔，目的是激活Nef蛋白的表达。细胞在37摄氏度和5%的二氧化碳环境中培养了48小时。之后，我们用含有相同浓度4-HT的新鲜培养基（1毫升）替换了旧的培养基，并继续培养了18小时，以便进行后续分析。

为了观察自噬流的情况，我们按照Cyto-ID®自噬检测试剂盒的说明书对细胞进行了处理。检测LC3B蛋白水平时，我们首先用2%的甲醛将细胞在冰上固定了20分钟，然后洗了一次，并使用0.1%的皂甙溶液在室温下对细胞进行了渗透处理15分钟。

接着，我们向样本中加入了Human BD Fc Block，并与细胞在室温下共孵育了10分钟。移除Human BD Fc Block后，我们再次将细胞悬浮在0.1%的皂甙溶液中，并用针对LC3B的一抗或它的同型对照抗体在冰上标记了30分钟。随后，我们使用针对小鼠IgG的二抗（Alexa Fluor® 488标记）在冰上标记了另外30分钟。最后，我们收集了细胞，将其洗净，并通过流式细胞仪进行了分析。

2.5.7. 进行体外HIV感染实验

我们在每个孔含有450微升培养基的24孔板中种植了大约80,000个Sup-T1细胞。我们向这些细胞中添加了含有纳米颗粒的PBS悬浮液（50微升），其最终浓度为1.3毫克/毫升，并在第一天开始处理。接着，细胞在37摄氏度和5%二氧化碳的条件下孵育了48小时。

之后，我们在新鲜培养基的24孔板中重新播种了相同密度的细胞，并在100毫摩尔的HEPES缓冲液（pH值为8.0）中加入了4微克/毫升的polybrene，然后用HIV-1 Bal病毒（由美国国立卫生研究院提供，目录号#510，批号#130361）进行感染，病毒的p24蛋白浓度为70皮克克/毫升，这一步在第三天进行。

细胞继续在培养箱中孵育了另外7天，每隔2天我们就进行一次细胞传代，并在每次传代时重新添加1.3毫克/毫升浓度的siRNA纳米颗粒进行处理。我们在实验的第5天、第7天和第9天收集培养上清，以便进行p24蛋白的检测分析。

2.6. 含有纳米颗粒的阴道凝胶的特性研究

2.6.1. 流变学分析

我们使用了AR550流变仪（位于美国新城的TA Instruments公司生产）和一个直径为20毫米、角度为2°的钢锥，在37摄氏度下测试了不同凝胶配方的流变学性质。

2.6.2. 从阴道凝胶中释放纳米颗粒

为了检查纳米颗粒从阴道凝胶中的释放情况，我们将C6-siRNA标记的纳米颗粒装载进了0.5%和1%的HEC凝胶中。然后，我们把含有纳米颗粒的1%和0.5%HEC凝胶各取50微升，放置在Transwell®可渗透支架上，这些支架上有一层3微米孔径的聚酯膜（由位于美国纽约的Corning公司生产），并将这些支架放入24孔板中。

每个孔的上侧我们加入了1毫升的VFS溶液作为释放介质。样品随后在37摄氏度的恒温振荡器上进行孵育（由位于加拿大安大略省的VWR公司生产）。在不同的时间点，我们从孔中取出200微升的释放介质，并加入新鲜的介质。通过板读取器（Synergy HT, BioTek公司生产）来定量分析释放出的纳米颗粒。

2.6.3. 通过阴道粘膜共培养模型研究纳米颗粒从阴道凝胶穿透阴道上皮层的能力

我们使用了一个稍作修改的阴道粘膜共培养模型来评估纳米颗粒的穿透性能。具体来说，我们将VK2/E6E7细胞种植在涂有I型胶原和纤维连接蛋白的聚碳酸酯膜上，这些膜是安装在直径为6.5毫米、孔径为3微米的Transwell®支架上的（由位于美国纽约的Corning公司生产），细胞的种植密度是每孔大约100,000个细胞。这些细胞被培养了大约一周，直到电阻值超过600欧姆每平方厘米，这表示形成了一个完整的细胞单层。

在实验当天，我们将大约80,000个Nef-ER细胞种植在24孔板的每个孔中，每孔加入了500微升的培养基，然后将含有VK2/E6E7细胞单层的Transwell®支架放入这些孔中。随后，我们在VK2/E6E7细胞的顶部（即上室）加入了含有纳米颗粒的0.5%HEC凝胶。在不同的时间点，我们收集了细胞并使用流式细胞仪进行了分析。同时，我们也分析了Transwell®支架中含有纳米颗粒的阴道凝胶培养基，使用板读取器进行了定量分析。

2.7. 在阴道粘膜共培养模型中敲除CCR5和Nef基因

在实验当天，我们将大约80,000个Nef-ER细胞种植在24孔板的每个孔中，每孔加入了450微升的培养基，然后把含有VK2/E6E7细胞单层的Transwell®支架放入这些孔中。我们在Transwell®的下方（即下室）用5微摩尔的4-羟基他莫昔芬处理了Nef-ER细胞，而在上方（即上室）用含有纳米颗粒的0.5%HEC凝胶处理了VK2/E6E7细胞。这些细胞分别被处理了48小时（为了检测mRNA水平的变化）和72小时（为了检测蛋白水平的变化）。我们使用之前提到的方法来分析mRNA和蛋白质水平的变化。

2.8. 进行体外细胞毒性测试

我们通过使用CellTiter 96® AQueous One Solution细胞增殖测试（MTS实验）来检测细胞毒性。Sup-T1细胞和VK2/E6E7细胞分别以每孔30,000和50,000的密度在96孔的组织培养板上种植（由位于安大略省的BD公司生产），每孔加入80微升的培养基。我们将不同浓度的纳米颗粒和含有纳米颗粒的0.5%HEC凝胶预先与培养基混合，然后加入到细胞中。这些细胞在37摄氏度和5%二氧化碳的环境下分别孵育了24小时或72小时。我们使用细胞培养基作为阴性对照组，而将含有1M丙烯酰胺的细胞培养基作为阳性对照组来评估细胞毒性。

处理结束后，我们将VK2/E6E7细胞清洗并换上新鲜的培养基，接着加入了20微升的MTS溶液并继续孵育了1小时。然后，我们使用微板读取器（由美国佛蒙特州的BioTek Instruments公司生产）在490纳米的波长下读取结果。对于Sup-T1细胞，我们直接加入了20微升的MTS溶液并同样孵育了1小时。作为对照组，我们也处理了没有细胞的配方样本，以便从实验组中扣除背景值。此外，我们还收集了每个处理组结束后的上清液，通过离心分离，然后根据制造商提供的说明使用ELISA方法来分析细胞因子的产生。

2.9. 抗体与纳米颗粒的结合及其在体外对CD4+细胞的靶向siRNA递送

我们将大约4毫克的纳米颗粒重新悬浮在含有0.1 M MES缓冲液的1700微升溶液中（这种缓冲液来自于加拿大安大略省的Millipore-Sigma公司，pH值为6.0）。接着，我们向这个悬浮液中加入了200微升的硫酸氢-NHS（浓度为275毫克/毫升，来自美国密苏里州的G-Biosciences公司）和100微升的EDC（浓度为200毫克/毫升，同样来自G-Biosciences公司）。

这个混合物在室温下搅拌了30分钟（速度为700转/分钟），目的是激活纳米颗粒上的羧基。之后，纳米颗粒在室温下先后经过10,000 xg和20,000 xg的离心（各5分钟）来去除多余的硫酸氢-NHS和EDC。然后，这些纳米颗粒被重新悬浮在含有0.1 M NaH2PO4的180微升溶液中（pH值为7.4），并加入了200微克的抗体（总体积为400微升），在室温下搅拌4小时（速度为1400转/分钟），以便抗体能够与纳米颗粒结合。

我们使用的是从加拿大安大略省的Abcam公司购买的小鼠单克隆抗人CD4抗体（RPA-T4）和对应的小鼠IgG1 κ同型对照抗体，以及从BD Biosciences公司购买的大鼠单克隆抗小鼠CD4抗体（RM4-5）和大鼠IgG2a κ同型对照抗体。最后，我们收集了处理后的纳米颗粒，进行了清洗，并将其加入到HEC凝胶中。

在实验中，我们在24孔板上种植了Sup-T1细胞，每孔大约有200,000个细胞，并加入了450微升的培养基。我们向这些细胞中加入了含有Cy-3标记的scramble siRNA NP-(h)CD4或NP-(h)IgG1的PBS悬浮液（50微升），最终浓度设为1.3毫克/毫升。接着，细胞在37摄氏度和5%二氧化碳的条件下孵育了2到8小时。处理结束后，我们用PBS清洗了细胞，并立即使用流式细胞仪进行了分析（使用的是位于加拿大安大略省的BD公司的Canto II设备）。

2.10. 在体内向CD4+细胞传递siRNA并实现基因敲除

我们的动物实验方案获得了曼尼托巴大学动物护理委员会的批准。我们从德国小鼠诊所购买了一批5到8周龄的雌性CD1小鼠，并在有足够食物和水的条件下，按12小时白天/12小时夜晚的周期养护它们。在开始治疗前5到7天，这些雌性小鼠通过皮下注射了2毫克的Depo-Provera（一种辉瑞公司的药物）进行预处理。

治疗当天，我们对小鼠进行了麻醉，并用100微升的PBS溶液清洗了它们的生殖系统三次，之后使用小钙藻酸钠尖头涂抹器（美国缅因州的Puritan公司生产）进行了擦拭处理。接着，我们将含有偶联到抗体上的纳米颗粒的1%HEC凝胶（总量为30微升）通过阴道给药，分别在早上和晚上进行，两次给药间隔8小时，连续进行了2天。给药后，小鼠在麻醉状态下保持了大约20分钟。

我们还进行了生物分布研究，使用了封装了Cy-3标记的乱序siRNA的配方来处理雌性小鼠，处理方法如上所述。在最后一次治疗24小时后，我们用100微升的PBS溶液再次清洗了它们的生殖系统三次，以去除任何残留的配方，并从心脏采集了血样。随后，小鼠被安乐死，我们收集了包括心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏以及整个生殖系统在内的器官。我们使用Perkin Elmer IVIS Spectrum设备来观察这些器官中Cy-3标记的乱序siRNA的分布情况，并使用Living Image软件进行了图像采集。

在实际的基因敲除实验中，我们选择CCR5基因作为目标，使用了Thermo Fisher公司提供的针对小鼠CCR5的siRNA（产品编号为4390816-s64112）并将其封装进配方中。治疗方案与上述相同，但在最后一次治疗48小时后，我们对小鼠进行了麻醉，清洗了整个生殖系统并在小鼠被安乐死后取出。然后，我们将这些组织样本浸泡在RNAlater®稳定液中，在4摄氏度下过夜，直至进行分析前一直保存在液氮中。

3.1. 确定siRNA纳米颗粒的N/P比例、粒径、zeta电位和释放特性

为了制定出最佳的siRNA纳米颗粒配方，我们首先需要找到一个合适的N/P比例（即聚乙烯亚胺的氮元素与siRNA的磷元素的摩尔比），这个比例能够完全压缩siRNA。我们测试了从0:1到6:1的N/P比例，并且发现在N/P比例达到或超过5:1时，所有的siRNA都能被完全压缩。因此，我们选择了5:1作为所有后续实验的最佳N/P比例。

我们还在两种不同的环境——PBS（pH 7.4）和VFS（pH 4.2）中测试了这种配方，因为开发微生物杀灭剂时需要考虑到不同的环境条件。我们的测试结果表明，在这两种缓冲液中，纳米颗粒的粒径稳定在260到270纳米之间，PDI（粒径分布指数）大约为0.2，这说明粒径分布相对均匀。在PBS（pH 7.4）中，纳米颗粒的zeta电位约为-15毫伏，但当环境改变到VFS（pH 4.2）时，zeta电位显著上升到接近中性（约-8.0毫伏）。

我们还对siRNA的初始加入量进行了调整，以找到最佳的封装效率（EE%）和载量。结果显示，当siRNA的初始加入量从50微克增加到100微克时，封装效率从86%略微下降到76%，但siRNA在纳米颗粒中的总装载量几乎翻了一倍。因此，我们确定使用100微克siRNA作为初始加入量的配方是最优的，因为进一步增加siRNA量会导致纳米颗粒的粒径显著增大（超过400纳米），并且封装效率进一步降低，这可能会影响纳米颗粒的稳定性并导致siRNA的损失。

当我们在不同的缓冲液条件下检测纳米颗粒配方释放siRNA的能力时，我们发现了一个很有趣的现象，即siRNA释放具有pH依赖性。正如图1所展示的，在pH值为7.4的PBS缓冲液中，纳米颗粒能够稳定释放siRNA，15天的总累积释放量达到了22.9 ± 0.4%。特别是，在最初的4小时里，我们观察到了一个突然释放的现象，释放量为8.3 ± 0.2%（图1A）。然而，在pH值为4.2的VFS环境中进行相同的实验时，我们发现释放速度明显降低，15天的总累积释放量不足6.0%（6.0 ± 0.4%），并且在最初的2天内的释放量不到2.0%（1.5 ± 0.0%）（图1B）。

基于这些结果，我们进一步将siRNA纳米颗粒在VFS中孵育了2天，之后完全更换为pH值为7.4的PBS缓冲液，以此来模拟从阴道环境到细胞内环境的真实生理变化。结果显示，当纳米颗粒仍在pH值为4.2的VFS中时，siRNA的释放率保持在不到2%（1.8 ± 0.0%）。但是，当释放介质更换为pH值为7.4的PBS后，siRNA的释放率在几小时内急剧上升至14.4 ± 0.4%。在接下来的15天里，siRNA的释放持续进行，最终总释放量约为37%（36.7 ± 1.2%）。这一发现表明，从pH值为4.2的VFS切换到pH值为7.4的PBS，能够显著促进siRNA的释放（图1C）。

3.2. 在体外测试siRNA纳米颗粒的细胞吸收、毒性和基因敲除效果

然后，我们着手检查了siRNA在体外的细胞吸收情况。我们选用了表达CD4水平高的Sup-T1细胞进行了实验。这些细胞被1.3毫克/毫升的Cy-3标记的乱序siRNA纳米颗粒处理，并在不同的时间段进行了孵化。正如图2A所展示的那样，随着时间的推移（2小时、6小时和24小时），细胞内积累的siRNA数量呈现出增加的趋势。

在明确了纳米颗粒的尺寸、zeta电位、释放行为以及细胞吸收特性之后，我们进一步将针对CCR5和Nef的siRNA共同封装进纳米颗粒中，旨在评估这种组合配方在基因敲除方面的效率。我们首先在mRNA水平上检查了不同浓度下Nef和CCR5基因敲除的效果。

在本研究中，所有涉及Nef基因敲除的实验都采用了一个特殊的体外细胞模型（Nef-ER），这个模型在添加4-羟基他莫昔芬（4-HT）后能够在Sup-T1细胞中快速启动Nef蛋白的表达。为了评价基因敲除效果，我们用5微摩尔的4-HT处理了Nef-ER细胞，并且添加了三种不同浓度的Nef-CCR5纳米颗粒（分别为0.334毫克/毫升、0.667毫克/毫升和1.334毫克/毫升），对应的siRNA剂量分别为6.31微克、12.6微克和25.2微克。

正如图2B-C所展示的，基因敲除的效果明显随着纳米颗粒浓度的增加而增强。在用0.334毫克/毫升的Nef-CCR5纳米颗粒处理细胞时，与单独使用4-羟基他莫昔芬和PBS处理或者混合4-羟基他莫昔芬和乱序siRNA纳米颗粒处理的组相比，Nef和CCR5的表达量并没有显著降低。

然而，当我们将浓度提高到0.667毫克/毫升时，可以观察到Nef的表达量下降了大约30%，但这种下降只与单独使用4-羟基他莫昔芬和PBS处理的组相比有显著差异，而与混合4-羟基他莫昔芬和乱序siRNA纳米颗粒处理的组相比并没有显著差异，这表明敲除效果不够理想。对于CCR5，这个浓度下达到了大约31%的基因敲除效果，并且与单独使用4-羟基他莫昔芬和PBS处理或者混合4-羟基他莫昔芬和乱序siRNA纳米颗粒处理的组相比有显著差异。

当浓度进一步提高到1.334毫克/毫升时，与单独使用4-羟基他莫昔芬和PBS处理或者混合4-羟基他莫昔芬和乱序siRNA纳米颗粒处理的组相比，我们观察到了Nef大约35%的显著下调和CCR5大约63%的显著下调。因此，1.3毫克/毫升的浓度因其达到了最高的mRNA敲除效率而被选为后续研究的最佳浓度。

接下来，我们利用选定的最佳浓度来检查Nef和CCR5在蛋白质层面的敲除效率。如图2D-G展示的那样，Nef蛋白的水平显著降低了大约63%，所有被激活的Nef都被减少了。CCR5蛋白的水平也显著降低了大约43%，带有CCR5标记的细胞群体从64%降至45%。因此，我们确定1.334毫克/毫升为进一步研究的最佳浓度。

我们的细胞毒性测试显示，三种不同浓度的处理（0.334毫克/毫升、0.667毫克/毫升和1.334毫克/毫升）对细胞活性没有造成显著影响（如图3A所示）。我们还收集了每个处理组的培养基，对促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL1-β和IL-8）进行了分析，以进一步评估我们配方在1.334毫克/毫升浓度下的细胞毒性特性。

正如图3B所显示的，IL1-β和TNF-α的水平低于商用ELISA试剂盒能够检测的最低限度，因此在图表中标记为0。我们观察到，在接受乱序siRNA纳米颗粒处理的组中IL-6水平有所下降，在接受Nef-CCR5纳米颗粒处理的组中，IL-6水平进一步降低，甚至低于检测范围。对于IL-8，所有处理组之间没有观察到显著差异。因此，1.334毫克/毫升的浓度被证明细胞可以很好地容忍，并且不会引发免疫反应。

3.3. 通过敲除Nef来在T细胞中重新启动自噬过程

我们下一步的目标是探讨Nef蛋白与T细胞中自噬过程抑制之间的关系。此前的研究已经显示，Nef的表达能够在巨噬细胞中抑制自噬过程。我们想进一步了解，这种抑制是否也存在于T细胞中，以及通过敲除Nef能否解除这种抑制。鉴于自噬是一个动态的过程，我们采用了三种不同的方法来衡量自噬的水平。首先，我们利用了一款市售的试剂盒来测定体外的自噬降解活性（即自噬流）。正如图4A所展示的，当通过4-HT诱导T细胞中的Nef时，与仅用4-HT处理的Sup-T1细胞相比，总体自噬流水平下降到了大约80%。

当细胞被1.334毫克/毫升的Nef-CCR5纳米颗粒处理时，诱导产生的Nef被完全消除，而自噬流的活性增加到了高于未经处理的Sup-T1细胞的水平。而当细胞仅被CCR5纳米颗粒处理时，自噬流的活性也有所增加。我们还通过测量LC3B蛋白的水平来进一步评估这些处理效果，LC3B蛋白是自噬体形成的一个标志物。如图4B所展示的，当T细胞内Nef被激活时，自噬体的数量增加了4倍。但是，当细胞接受Nef-CCR5纳米颗粒处理后，自噬体的数量恢复到了初始水平；然而，当细胞接受乱序siRNA和CCR5纳米颗粒的处理时，自噬体的数量没有变化。

图4C展示了四个与自噬过程调控相关的基因（Beclin-1、VPS34、TECPR1、UVRAG）表达的变化。当Nef在细胞内被激活时，仅有Beclin-1的表达上调了40%，而在CCR5被敲除或Nef和CCR5同时被敲除的情况下，这一表达水平保持不变。

然而，同时敲除CCR5和Nef显著促进了VPS34（大约80%）、TECPR1（大约40%）和UVRAG（大约80%）的表达上调，这三个基因的表达水平甚至超过了Sup-T1细胞在接受乱序siRNA和4-羟基他莫昔芬处理后的初始水平。与仅接受乱序siRNA和4-羟基他莫昔芬处理的组相比，仅敲除CCR5并不能促进Beclin-1、VPS34、TECPR和UVRAG等基因的表达。

3.4. 体外利用siRNA纳米颗粒阻断HIV

然后，我们对我们研发的组合siRNA纳米颗粒配方在体外抵抗HIV的效能进行了评估。在9天的实验期间，Sup-T1细胞以1.334毫克/毫升的最佳浓度接受了纳米颗粒的处理，并每两天进行一次细胞传代。在HIV Bal病毒挑战前两天，细胞先接受了纳米颗粒配方/药物的预处理。图4D展示了在每两天的间隔中，p24蛋白的浓度变化。

我们的组合siRNA纳米颗粒配方在所有处理方法中显示出最强的抑制效果，在每个两天的间隔中，与PBS相比，p24蛋白的浓度分别下降了约47%、63%和71.8%。含有单一治疗性siRNA（siRNA Nef或siRNA CCR5）和乱序siRNA的纳米颗粒配方，展现了与蛋白酶抑制剂阿扎那韦 (Atazanavir)相似的抑制效果，在整个实验期间，所有这三种处理方式均使p24蛋白浓度降低了30%至50%（与PBS相比）。在实验的前两天（第3-5天），与PBS相比，乱序siRNA纳米颗粒配方使p24蛋白浓度降低了约41%，但在此之后，其产生的p24蛋白水平与PBS相似（图4E）。

总体来说，我们的组合siRNA纳米颗粒配方在整个实验期间展现了最大的累计p24蛋白降低率（约60%），其次是含有单一治疗性siRNA（siRNA CCR5或siRNA Nef或乱序siRNA）和阿扎那韦(Atazanavir)的纳米颗粒配方，在研究结束时总共减少了大约37%。

3.5. 阴道凝胶释放纳米颗粒的研究及含有siRNA纳米颗粒的阴道凝胶的流变特性

在完成纳米颗粒（NP）的优化和表征工作后，我们进一步将这些纳米颗粒制成凝胶剂型（比例为1毫克纳米颗粒配合30毫克凝胶）。首先，我们进行了一个研究，以确定这些装载进凝胶的纳米颗粒是否能有效地从凝胶中释放出来，特别是使用了标记有C6-siRNA的纳米颗粒。图5A展示了从0.5%和1%的羟乙基纤维素（HEC）凝胶中释放纳米颗粒的体外剖面对比。结果表明，0.5%的HEC凝胶与1%的凝胶相比，具有更高的释放速率，在48小时内有超过17%的纳米颗粒被释放。

随后，我们还检测了不同浓度的空白凝胶和含纳米颗粒的凝胶的流变特性。正如图5B所展示的，0.5%和1%的HEC空白凝胶以及含纳米颗粒的凝胶的流动曲线都表现出了非牛顿流体的剪切稀化行为，而且纳米颗粒的加入提高了凝胶的粘度。这意味着随着剪切速率的提高，凝胶的粘度会降低，从而使纳米颗粒更易于释放进入阴道道，以便阴道细胞能够吸收。这种剪切速率的变化模拟了由人类或小鼠运动产生的压力。

鉴于0.5%的HEC凝胶展现出较高的纳米颗粒释放率，我们决定继续利用这一配方进行后续的研究。

3.6. 阴道粘膜共培养模型中纳米颗粒穿透阴道上皮层的研究

为了更贴近阴道实际的生理环境和细胞构成，我们利用了一个先前建立的阴道粘膜共培养模型来评估我们开发的0.5% HEC凝胶中加载纳米颗粒的配方（配比为1毫克纳米颗粒配合30毫克凝胶），相应的示意图展示在图5C中。我们首先探究了这个模型中纳米颗粒的渗透能力及其被细胞吸收的情况。

在这项研究中，我们采用了0.125克/毫升的0.5% HEC凝胶装载纳米颗粒来处理上层室的VK2/E6E7细胞，这是因为根据我们的MTS实验结果（图5D所示），这是一个在24小时内不会对细胞活性造成显著影响的最大浓度。

正如图5E所示，随着时间的推移，穿过VK2/E6E7单层细胞的纳米颗粒百分比逐渐增加，到了48小时时，超过12%的纳米颗粒从凝胶中穿透了阴道上皮层。我们还发现，当这种配方被应用于共培养模型时，0.5% HEC凝胶中的纳米颗粒被VK2/E6E7细胞迅速吸收，并在4小时内达到饱和阶段，持续了24小时。

当孵化时间延长至48小时时，没有观察到进一步的增加。这说明在一段时间内，纳米颗粒会先在阴道上皮层达到饱和状态，然后再穿透过去。穿透到下层室的纳米颗粒能被Sup-T1细胞迅速吸收，因为随着纳米颗粒穿透过程的进行，Sup-T1细胞中的平均荧光强度（MFI）随时间增长而提高（图5F所示）。

3.7. 含有siRNA纳米颗粒的阴道凝胶在体外的细胞毒性与基因敲除效能

在确认纳米颗粒可以从凝胶中释放并能够穿透阴道粘膜共培养模型后，我们进一步研究了该配方在基因敲除方面的效果。图6展示了使用0.5%的HEC凝胶携带的Nef-CCR5纳米颗粒（每30毫克凝胶中含1毫克纳米颗粒）在阴道粘膜共培养模型中对Nef和CCR5基因敲除的效果。在这个实验中，共培养模型同时被0.125克/毫升的0.5% HEC凝胶和5微摩尔的4-HT处理，保持配方在上层室72小时。

然后，通过裂解细胞来分析Nef和CCR5的表达。实验结束时，我们重新测量了VK2/E6E7细胞层的跨上皮电阻，结果显示处理前后电阻未发生变化（图6A），意味着细胞层的完整性未受影响。Nef-ER细胞中的Nef mRNA表达降至66%，与未加4-HT处理的Nef-ER细胞相同（图6B），说明所有被激活的Nef mRNA都被成功敲除。对于CCR5，其mRNA水平在同一时间降至51%（图6C）。

我们还通过测定蛋白水平的变化来确认了Nef和CCR5的敲除效果。尽管诱导产生的Nef并未被完全敲除，但Nef和CCR5的蛋白水平都显著下降到了大约70%（图7A）。此外，表达CCR5的细胞群体也从67%减少到了55%（图7B-D）。

在我们的阴道粘膜共培养模型实验中，我们特别关注了炎症相关的细胞因子水平，这是为了验证细胞毒性的表现（参见图8）。实验结果表明，无论是使用PBS溶液还是不同的纳米颗粒（NP）配方进行处理，TNF-α、IL-6和IL-8这几种炎症因子在VK2/E6E7细胞和Nef-ER细胞中的水平都没有发生变化。值得注意的是，当使用装有乱序NP的0.5% HEC凝胶或者装有Nef-CCR5 NP的0.5% HEC凝胶进行处理时，我们观察到VK2/E6E7细胞中IL1-β的水平下降了大约40%。

此外，当我们向Nef-ER细胞（位于模型下层的细胞）添加4-羟基他莫昔芬（4-HT）时，IL-8的水平在这些细胞中大约增加了50%。因此，无论是使用装有乱序NP的0.5% HEC凝胶还是装有Nef-CCR5 NP的0.5% HEC凝胶，都没有在阴道粘膜共培养模型中的VK2/E6E7细胞或Nef-ER细胞中引起任何促炎细胞因子的增加。

最后，我们将我们研制的药物配方在小鼠身上进行了测试。不过，在我们第一次尝试评估小鼠阴道组织对含有Cy-3标记的乱序siRNA纳米颗粒的0.5% HEC凝胶（每30毫克凝胶含有1毫克的siRNA纳米颗粒）的吸收效果时，我们发现整体吸收效率比较低，而且在阴道的某些区域，几乎检测不到siRNA的吸收（相关数据未展示）。

为了提高治疗性siRNA进入其目标细胞的效率，我们决定给纳米颗粒（NP）表面连接抗CD4抗体，这样做是为了增强这些纳米颗粒进入CD4+细胞的能力。经过这样处理后，纳米颗粒的平均大小为295.6 ± 9.2纳米，PBS中的zeta电位为-9.51 ± 0.30毫伏，而在pH值为4.2的阴道模拟液（VFS）中，粒径为307.2 ± 5.2纳米，zeta电位为-3.54 ± 0.63毫伏。

我们对高表达CD4的Sup-T1细胞使用了连接了抗人CD4单克隆抗体的Cy-3标记乱序NP（Cy-3 scramble NP-(h)CD4），并比较了不同时间点siRNA的细胞内吸收效果。作为对照，我们也使用了连接了IgG单克隆抗体（作为同种对照）的NP。结果表明，连接CD4抗体显著提高了siRNA在细胞内的吸收，分别在2小时、4小时、6小时后吸收量增加了大约66%、100%和62%。

有了这些积极的体外靶向结果，我们把连接了抗体的纳米颗粒包裹进0.5%的HEC凝胶中，并在小鼠模型中测试这种最终配方对提高阴道内siRNA递送效率的能力。我们对小鼠每天两次连续给予两天，分别使用PBS、含Cy-3标记乱序NP-(m)IgG和含Cy-3标记乱序NP-(m)CD4的0.5% HEC凝胶。为了确保测量到的荧光siRNA信号不是来自于陷入宫颈阴道黏液中的配方，我们在实施安乐死和收集组织前，对每只动物进行了三次用100微升PBS进行的阴道冲洗。

图9B展示了一个有趣的发现：当我们使用含有Cy-3标记乱序NP-(m)CD4的0.5% HEC凝胶对小鼠进行处理时，发现siRNA能够显著增加其在阴道组织的整体吸收，并且这些siRNA在整个阴道内的分布相当均匀。相反，当使用含有Cy-3标记乱序NP-(m)IgG的0.5% HEC凝胶时，siRNA的检测主要集中在阴道的入口处及其上下两端的小片区域。更值得注意的是，在心脏、血液、肝、脾、肾和肺等其他器官中几乎检测不到这些荧光标记的siRNA（如图9C所示）。

为了深入探究siRNA吸收改善是否能够在CD4+细胞中带来更好的基因敲除效果，我们选择了CCR5作为目标基因进行研究。我们将针对小鼠CCR5的siRNA包裹在纳米颗粒中，并将其制备成0.5% HEC凝胶。实验小鼠的处理方式与前文提到的相同。我们通过流式细胞术，测量了下阴道和上宫颈阴道区域内CD4+和CD4-细胞中CCR5蛋白水平的变化。

研究结果表明，在宫颈阴道区域的CD4+细胞中，观察到了显著的基因敲除现象，这表明通过抗CD4抗体与纳米颗粒的结合，我们的RNA干扰基纳米药物能够精准地在CD4+细胞中达到目标基因的敲除，而不会影响阴道中CD4-细胞的基因表达。此外，含有CCR5 siRNA的0.5% HEC凝胶NP-(m)CD4在下阴道和上宫颈阴道区域的CD4+细胞中分别实现了大约40%和36%的CCR5基因敲除效果，而含有CCR5 siRNA的0.5% HEC凝胶NP-(m)IgG则未在任何区域的CD4+细胞中达到敲除效果（如图9D-G所示）。

3.8. 统计方法说明

我们对所有实验进行了重复，以确保结果的可靠性。这里报告的数据表示为平均值及其标准差。除非另有说明，我们通常会用非参数的单向方差分析（也就是Tukey检验），来对多个样本进行比较，当p值小于0.05时，我们认为差异是有统计学意义的。

所谓的N/P比率，实际上是指负电荷的siRNA和正电荷的PEI之间的比例。通过PEI与siRNA之间的静电相互作用，siRNA被压缩成siRNA-PEI复合物。我们发现，当N/P比率为5时，相较于更高的比率，可以视为最佳状态。因为如果N/P比率过高，会因为静电作用过强而使siRNA形成更紧密的复合物，这样可能就会妨碍siRNA从纳米颗粒中释放出来。

以往的研究表明，对于那些不依赖粘附作用的纳米系统来说，200-500纳米的粒径和接近中性的-10到10毫伏的zeta电位是比较理想的。我们的siRNA纳米颗粒在pH值为4.2的VFS中测量得到的粒径和zeta电位正好处于这个理想范围内，因此，我们有理由相信这些siRNA纳米颗粒有望实现更好的穿透粘液层的能力。当然，为了验证这一点，我们还需要进行更多的实验。

我们发现，关于siRNA纳米颗粒（NP）在不同pH环境下的特殊释放行为，目前还没有先前的研究记录。我们推测，这种现象可能跟siRNA从siRNA-PEI复合物中的解离速度有关，或者是PLGA-PEG材料在不同pH环境下降解速度的差异导致siRNA释放速度不同。为了深入探究，我们对未经封装的siRNA-PEI复合物进行了一系列实验，这些实验的条件与图5中展示的相同。

实验结果显示，当我们将释放介质从VFS（pH值为4.2）切换到PBS（pH值为7.4）时，这些复合物自身只能提供大约2.3%的快速释放，这一数值远低于我们从siRNA纳米颗粒中观察到的释放量，低了将近7倍。因此，我们认为，这种pH响应的释放行为不完全是由siRNA从siRNA-PEI复合物解离速度的变化所致。

接下来，我们参考了之前的研究，尤其是何等人对PLGA（比例为80:20）-PEG-甲酯在不同pH值（5.0、7.4和9.1）PBS环境下的降解速率进行了比较的研究。根据他们的发现，PLGA（80:20）-PEG-甲酯在pH 7.4环境下的降解速率比在pH 5.0时要高，在pH 9.1时降解速率更是显著增加，整个实验持续了8周，而最明显的差异是在实验的前两周内观察到的。尽管我们使用的PLGA-PEG的具体组成与他们的研究中使用的不同，但这些结果在一定程度上支持了我们自己的发现。

在我们的实验中，我们使用的PLGA（50:50）-PEG-COOH与另一种PLGA（80:20）-PEG-甲酯不同，同时实验中使用的释放介质也有所差异。我们推测，VFS的酸性环境对于减慢PLGA-PEG材料降解速度起到了关键作用，不过这背后的具体原理我们还不完全清楚。我们注意到，当NP事先在酸性的VFS中预孵育时，会增强它们在中性pH的PBS中释放siRNA的能力。

这种现象很可能是由于预孵育使得更多的水分渗透或扩散进入NP中造成的。PLGA-PEG的降解是通过水解作用发生的，而水解作用需要水的参与。酸性环境在NP处于VFS中时显著地阻碍了水解过程，但当释放介质换成中性pH的PBS时，水解过程会立即恢复，并且NP内部更多的水分含量可能会加速水解和降解过程，从而导致更多的siRNA释放出来。

我们还发现，一旦siRNA NP进入细胞内，如何从内体中逃逸出来将是一个挑战。我们猜测，我们配方中添加的PEI可能通过所谓的“质子海绵效应”帮助siRNA从内体中逃逸，但这一点还需要通过更多研究来验证。

HIV中的Nef蛋白质是与雌激素受体的激素结合部分结合在一起共同表达的，这种结构让Nef处于一种因为结构上的阻碍而不活跃的状态。当我们加入4-羟基他莫昔芬（一种化学物质）时，它会与雌激素受体的结合部分作用，解除这种阻碍，使Nef蛋白质在细胞内变得活跃。

如果不加4-羟基他莫昔芬，那么Nef-ER细胞就会产生非活性的Nef mRNA和蛋白，但是我们可以通过检测发现它们的存在。实验证明，加入4-羟基他莫昔芬可以让Nef的mRNA表达量增加大约40%，蛋白质表达量增加两倍。这种在mRNA和蛋白质水平上表达的不同可能是因为我们使用的检测方法不同造成的。比如，通过qRT-PCR技术，我们无法区分Nef是活跃状态还是非活跃状态，但是通过ELISA技术，当Nef不活跃时，其与抗体结合的位置可能就不可见了。

4-羟基他莫昔芬的加入不仅使Nef活跃起来，还促进了其基因的表达量增加，而Nef蛋白质水平两倍的提升则是由于Nef基因表达上调大约40%和Nef蛋白的活化共同作用的结果。在1.334毫克/毫升的最佳浓度下，无论是Nef的mRNA还是蛋白质都能被降低到不加4-羟基他莫昔芬处理的Nef-ER细胞的原始水平。

在研究中，我们注意到在接受了带有随机序列的纳米颗粒加4-HT和Nef-CCR5纳米颗粒加4-HT处理的实验组里，IL-6的水平有了显著的下降。这个观察结果可能和IL-6 ELISA检测套件的最低量化限3 pg/mL有关。T细胞产生的IL-6量很少（大约或低于10 pg/mL），所以当浓度接近这个最低量化限时，可能会出现更多的测量误差，这或许可以解释为什么我们在接受随机序列纳米颗粒加4-HT处理的组里看到了IL-6水平的显著下降。

对于同时接受了针对Nef和CCR5 siRNA加4-HT处理的组，我们发现CCR5的表达显著下降，这可能是导致IL-6水平下降的主要原因。之前的研究已经显示，CCR5能促进人类滑膜成纤维细胞产生IL-6，因此敲低CCR5可能会减少IL-6的生成。这个效果在阴道粘膜的共培养模型中并未观察到，可能是因为在直接对细胞处理的情况下，CCR5下降的幅度没有在Nef-ER模型中那么大。

在阴道粘膜共培养模型的实验中，我们的配方并没有引起任何促炎细胞因子的生成。目前我们还不清楚为何在阴道粘膜共培养模型中VK2/E6E7细胞接受0.5% HEC凝胶载体（不论是载有随机序列的纳米颗粒还是Nef-CCR5纳米颗粒）的处理会导致IL1-β的降低，这个问题可能在未来的研究中得到解答。

在我们研究自噬过程中特别是自噬降解活性的实验里，我们发现通过技术手段消除了所有被激活的Nef蛋白后，自噬活性的水平竟然比对照组（也就是用随机序列纳米颗粒加4-HT处理的Sup-T1细胞）的自然自噬水平还要高。按理说，当Nef蛋白在T细胞中被激活时，由于它是一种外来蛋白，本应该引发自噬活性的增加，但我们在经Nef-ER加随机序列纳米颗粒和4-HT处理的实验组中并没有观察到这种增加。

这是因为Nef蛋白不仅抑制了自噬过程，还阻碍了正常细胞中的日常清理作用（家务性自噬），导致我们在这个实验组中观察到的自噬活性实际上比日常水平还要低。因此，我们在经Nef-ER加Nef-CCR5纳米颗粒和4-HT处理的实验组中观察到的高自噬活性，很可能接近于由Nef蛋白激发的那部分未被直接观测到的自噬活性水平。

LC3B蛋白的水平可以反映自噬体的多少。自噬体数量的增加可能是因为它们形成得更好或者降解得更慢。先前的研究显示，Nef蛋白主要作用在自噬的降解过程上，阻止HIV病毒的新产物被自噬系统清除。在自噬体被降解的过程中，它们就像身体中的其他成分一样被分解。

因此，在我们这个例子里，LC3B蛋白水平的变化应该与自噬降解过程的变化紧密相关。特别是在加了4-HT的Nef-ER细胞和乱序纳米颗粒处理的组中，我们发现LC3B蛋白的水平上升了，这很可能是因为Nef蛋白阻断了自噬体的降解过程。而通过降低Nef蛋白的水平，我们能够恢复原本被Nef阻断的自噬降解过程，这与之前的研究结果一致，那些研究发现缺失Nef蛋白的HIV病毒能够降低LC3B蛋白的水平。

此外，Nef蛋白的激活还促进了Beclin-1基因的表达。尽管之前的研究表明Nef蛋白通过与LC3B蛋白相互作用抑制自噬降解过程，但Beclin-1蛋白和LC3B蛋白之间的具体关系还不太清楚。敲除Nef蛋白能够解除自噬过程的阻断，并促进了VPS34、TECPR1和UVRAG等自噬相关基因的表达。不过，我们还需要更多研究来详细了解Nef蛋白和这些自噬调控蛋白之间的具体互作，以及它们在Nef蛋白被敲除时对促进自噬过程的作用。

此外，我们发现敲除CCR5蛋白似乎能增加自噬流的水平，但LC3B蛋白的水平和自噬调节基因的表达并没有变化。我们不想仅凭目前的实验结果就断定CCR5蛋白在自噬中有作用，因为Nef-ER细胞模型主要是为了研究Nef蛋白而不是CCR5蛋白的。将来，我们需要进行更适当的实验来探究CCR5蛋白在自噬过程中是否真的发挥作用。

随着Nef-CCR5纳米颗粒（NP）的反复使用，我们发现它对HIV的阻断作用逐渐增强，这可能是因为我们达到了更高的基因敲除效果。我们用一种叫做阿扎那韦(Atazanavir)的蛋白酶抑制剂作为参照，来评估这种新配方对抗HIV的效力，正如先前研究中使用的那样，药物的浓度也是相同的。

结果表明，这种含有特定siRNA的纳米颗粒配方在抗击HIV方面比阿扎那韦(Atazanavir)更有效，这可能是因为同时在病毒生命周期的两个不同阶段或位置上进行抑制，比只在一个阶段或位置上进行抑制要有效得多。这就像在临床上使用的高效抗逆转录病毒治疗策略一样，至少需要将三种来自相同或不同类别的药物组合使用，以提高治疗效果并降低药物抗性的风险。

在水性环境中，荧光标记的siRNA（比如Cy-3）能很快从纳米颗粒中释放出来，所以直接用荧光siRNA包裹的纳米颗粒来衡量纳米颗粒的数量并不合适。因此，我们选择了另一种荧光物质香豆素6，和未进行标记的siRNA一起封装进纳米颗粒里，用来研究这些纳米颗粒从凝胶中的释放情况以及它们如何穿过阴道上皮层的。使用香豆素6来追踪纳米颗粒在细胞内的分布是一个经过验证的方法。在没有加入表面活性剂的情况下，香豆素6从纳米颗粒中的释放可以忽略不计。

这样，我们检测到的荧光信号就能很好地反映纳米颗粒被释放、穿透或被细胞吸收的数量。纳米颗粒穿越阴道上皮层的过程似乎是限制它们被Sup-T1细胞吸收的关键步骤。在阴道粘膜的共培养模型中，大多数香豆素6标记的纳米颗粒首先被阴道上皮细胞吸收，这是因为这些细胞是第一个接触到纳米颗粒的，并且与纳米颗粒有足够的相互作用。

当纳米颗粒成功穿过上皮层后，它们被细胞吸收的过程就开始加速了。Sup-T1细胞在下层达到纳米颗粒饱和吸收的状态大约需要两天时间。所以，阴道上皮既是阻挡入侵病原体的屏障，也是纳米颗粒传输的障碍。目前还没有找到一种高效渗透阴道上皮的纳米颗粒技术，而不损害上皮的完整性，这使得这个研究领域既吸引人又充满挑战。

由于小鼠的阴道里缺少乳酸杆菌，它们的阴道pH值通常是中性的。siRNA制成的纳米颗粒在这样的环境下呈现负电荷，大约是-15毫伏。细胞表面本身也带负电，因此这些纳米颗粒因为电荷相斥，可能很难被阴道细胞吸收。但当我们将抗体连结到纳米颗粒上，它们的表面电荷就接近于中性，这样就减少了相斥效应。抗体与细胞表面受体之间的紧密结合还帮助纳米颗粒更好地进入阴道细胞。

关于这些纳米颗粒如何穿过阴道上皮的具体方式还不完全清楚，但可能有两种路径：一种是通过细胞之间的空隙，另一种是直接穿过细胞。研究表明，阴道上皮的最外层并没有细胞连接，这意味着一些小颗粒可以通过这些空隙移动。但在上皮的中间和底层，紧密连接的存在使得纳米颗粒很难通过这种细胞间通道。以前的研究显示，直径小于300纳米的纳米囊能够直接穿过肠道上皮细胞。

也有研究发现纳米颗粒能从小鼠的阴道运输到周围的淋巴结，但这种运输是通过细胞转运还是因为粘膜表面吸收纳米颗粒后的免疫细胞迁移，目前还不确定。因此，纳米颗粒可能通过一种称为跨细胞运输的方式，在阴道中实现更深层的穿透。研究还发现，阴道上皮细胞层的厚度在月经周期的不同阶段会有所变化，这增加了这一研究领域的复杂性。

为了这项研究，我们决定在我们的动物模型中使用Depo Provera来暂停动情周期，以确保观察到的基因敲除效率的变化不会被归因于组织渗透性的变化，而是配方的影响。同样重要的是要注意，Depo Provera的使用可能会通过损害阴道上皮屏障和增加HIV目标细胞的招募，增加人化小鼠模型对HIV阴道感染的易感性。

未来，在评估抗HIV活性时，我们不打算在动物模型中预先使用Depo Provera。许多临床前和临床报告已表明凝胶的安全性、兼容性和可接受性，使其成为治疗和预防性传播感染的一个非常有希望的剂型。与其他阴道剂型相比，凝胶具有最接近宫颈阴道粘液的理化性质；因此，它是最可行的配方，用于阴道内使用，而不会显著扰乱宫颈阴道粘液，后者是对抗侵入性病原体的重要屏障。

与非粘附性液体制剂相比，使用生物粘附聚合物（如羧甲基纤维素钠、HEC、卡波姆-PEG和羟丙基甲基纤维素）制备的凝胶能够更长时间地粘附于组织，并增加组织对凝胶中活性成分的暴露时间。同样重要的是要注意，非粘膜粘附性纳米颗粒的最佳尺寸范围在200到500纳米之间，理想的zeta电位是-10毫伏到10毫伏（接近中性）。在VFS中测量的siRNA NP的粒径约为271.6 ± 1.8毫米，而zeta电位约为-8.66 ± 2.43毫伏，两者均处于最佳范围内。因此，siRNA NP具有很大的潜力穿透阴道粘液，但需要进一步的研究来确认这一点。

注释：

Depo Provera：这是一种药物的商标名，用于避孕和调节动物模型的动情周期。

HIV：人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus），是导致艾滋病的病毒。

siRNA：小干扰RNA（small interfering RNA），一种能够在细胞内特异性沉默特定基因表达的分子。

NP：纳米颗粒（Nanoparticles），指的是在纳米尺度上的微小颗粒，本文中指的是载有siRNA的纳米颗粒。