诱导HIV潜伏期再激活，Tat-LNP为治愈HIV提供可能！

文章原题为“含有 Tat RNA 的纳米颗粒可有效逆转潜伏期，从而能够对 HIV-1 储存库进行多组学分析”作者为Marion Pardons等人。文章2023年12月18日在《Nature Communications》上在线发表。

这篇文章主要介绍了一种名为Tat-LNP的创新纳米粒子，它在治疗HIV方面展现了巨大潜力。Tat-LNP能够有效地激活HIV感染者体内处于潜伏状态的HIV病毒，而不会对身体的其他部分造成显著影响。这种方法通过唤醒隐藏的病毒，使其暴露于免疫系统和现有的抗病毒药物中，从而为彻底清除体内HIV病毒提供了一种新思路。这一发现为HIV的治疗和根除开辟了新的可能性，给HIV携带者带来了希望。

在HIV研究领域，一种既能有效唤醒HIV病毒又不全面激活T细胞的新型潜伏期逆转剂的研发，不仅对于探索HIV储藏库非常重要，而且可能开启通往功能性治愈的新路径。我们研究了一种含Tat mRNA的脂质纳米粒子（Tat-LNP）对接受抗逆转录病毒治疗的HIV患者的CD4 T细胞的影响。

实验发现，结合帕比司他使用Tat-LNP可以使更多潜伏的HIV病毒被激活（效果比PMA/离子霉素强大约4倍）。关键的是，Tat-LNP并不改变CD4 T细胞的基因表达模式，这意味着我们能更准确地分析潜伏期的HIV感染细胞。激活后，我们发现带有可诱导嵌合病毒的感染细胞和未感染细胞在基因表达上有显著不同（如LINC02964、GZMA、CCL5等）。

这些差异在蛋白水平上也得到了验证，并发现长链非编码RNA LINC02964在HIV活跃感染中可能发挥作用。此外，我们还发现p24阳性细胞在PI3K/Akt信号传导上更为活跃，同时降低了蛋白质合成，这表明HIV感染细胞具有助于其长期存活的独特生物标记。因此，Tat-LNP不仅在体外HIV储库研究中非常有价值，而且大大促进了对HIV储库细胞的基因和蛋白质特征的深入分析。

在接受抗逆转录病毒治疗（ART）的人群中，HIV在各种细胞和解剖结构储库中的长期潜伏是根除HIV的一大挑战。目前，像邻苯二甲酸酯（PMA）和抗CD3/CD28抗体这样的强效促分裂原是最有效的潜伏期逆转剂（LRAs），它们在体外实验中被视为实现最大程度激活的标准方法。

但这些分子会严重改变CD4 T细胞的特性，影响我们对近乎原始状态的可诱导HIV-1储库的分析。鉴于促分裂原在临床应用上的毒性和缺乏特异性，人们通过药物再利用研究找到了适用于人类的、耐受性好的LRAs，如组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）和蛋白激酶C（PKC）激动剂。

然而，这些化合物的激活效果并不如体外促分裂原那样显著，而且在ART治疗下的个体中应用这些化合物并没有显著减小HIV储库的规模，也没有延迟停用ART后病毒的反弹。病毒蛋白Tat在HIV转录中发挥关键作用，调节活跃与潜伏感染之间的转换，因此成为潜伏期逆转策略的理想选择。

尽管先前的研究已经利用外源性Tat成功地在细胞系和接受ART治疗的人的原代细胞中重新激活了潜伏的HIV，但Tat蛋白容易被困在内体中，可能限制其激活潜力。为解决这一问题，最近开发了一种含有Tat mRNA的脂质纳米粒子，称为LNP-2-T66 RNA（本文中称为Tat-LNP）。

Tat-LNP已在ART治疗个体的原代CD4 T细胞中显示出重新激活HIV的能力。我们研究了Tat-LNP与组蛋白去乙酰化酶抑制剂帕比司他（PNB）的协同效应，并将这种组合的激活潜力与当前的标准方法PMA/离子霉素（PMA/i）进行了比较，使用了HIV-Flow实验。

此外，我们利用最近开发的STIP-Seq实验研究了使用Tat-LNP/PNB和PMA/i激活的HIV-1嵌合病毒之间的重叠，该实验可以从单个分选的p24阳性细胞中同时获得整合位点（IS）和近全长（NFL）嵌合病毒序列。

最后，我们证明Tat-LNP不会改变CD4 T细胞的特性，并强调了使用Tat-LNP作为工具来揭示感染HIV的CD4 T细胞中携带可诱导嵌合病毒与未感染CD4 T细胞之间的转录组和蛋白质组差异的可能性。

参与者和血液采集

本研究纳入了23名HIV-1血清阳性个体，这些个体正在接受稳定的抗逆转录病毒治疗（ART）（见补充表1）。参与者在根特大学医院招募。在这23名参与者中，有2名女性和21名男性；我们研究中女性参与者的较少代表性直接反映了比利时HIV-1血清阳性人群的构成，这一群体主要由与同性发生性关系的男性组成。

参与者进行了白细胞分离术，以收集大量的外周血单核细胞（PBMC）。PBMC通过Ficoll密度梯度离心法分离，并在液氮中冷冻保存。

纳入条件和伦理声明

所有参与者均为成年人，并已提供书面知情同意。这三项研究及其研究方案均已获得比利时根特大学医院伦理委员会的批准（EC编号：STAR 2015/089458；ISALA 2015/077159；Mercuri BC-07056）。

所有MRC参与者均作为本研究的一部分被招募（Mercuri研究，NCT04305665）。STAR10和UZG3034分别作为STAR（NCT02641756）和ISALA（NCT02590354）研究的一部分被招募。这两位参与者在刺激后显示出较高频率的p24阳性细胞。

他们的纳入进一步扩大了我们研究的参与者群体（例如，对p24阳性细胞的表型和STIP-Seq/Smart-seq2分析）。本文中呈现的分析均在这三个研究方案的范围内。在这些研究中没有进行任何实验性药物给药。

抗体

可固定的活性染色剂510来自ThermoFisher Scientific（#L34957, 1/1000）。以下抗体在染色实验中被使用：CD3 AF700 克隆UCHT1（BD Biosciences, #557943, 1/50），CD4 PE-Cy7 克隆L200（BD Bioscience, #560644, 1/200）和CD4 BV786 克隆SK3（BD Biosciences, #563881, 1/200），

CD8 BV510 克隆RPA-T8（BioLegend, #301047, 1/200），CD45RO BV421 克隆UCHL1（BD Biosciences, #562649, 1/100）或CD45RO PE 克隆HI100（BD Biosciences, #5555493, 1/20），CD27 BV605 克隆L128（BD Biosciences, #562656, 1/100），

PD1 BB700 克隆EH12.1（BD Biosciences, #566461, 1/100），CD69 PerCP-Cy5.5 克隆FN50（BD Biosciences, #560738）和CD69 APC（BioLegend, #310909, 1/50），

CD25 BV421 克隆M-A251（BD Biosciences, #562443, 1/50），HLA-DR FITC 克隆REA805（Miltenyi Biotech, #130-111-788, 1/50），GZMA PE-Cy7 克隆CB9（BioLegend, #507221, 1/25），GZMB PB 克隆GB11（BioLegend, #515407, 1/50），CCL5 PerCP-Cy5.5 克隆VL1（BioLegend, #515507, 1/50），CD127 PE-CF594 克隆HIL-7R-M21（BD Biosciences, #562397, 1/50）。

对于p24染色，我们使用了两种抗体的组合：p24 KC57-FITC（Beckman Coulter, #6604665, 1/500）和p24 28B7-APC（MediMabs, #MM-0289-APC, 1/400）。

CD4 T细胞的阴性选择

使用EasySep Human CD4 T Cell Enrichment Kit（StemCell Technology, #19052），通过阴性磁选择法从PBMC中分离出CD4 T细胞。纯度通常超过98%。

CD4 T细胞刺激

CD4 T细胞在RPMI + 10%胎牛血清中以每毫升2×10^6个细胞的浓度重悬，并加入抗逆转录病毒药物（200 nM raltegravir和200 nM lamivudine）以避免新的病毒复制周期。

细胞在37°C下静置至少一小时，然后用以下LRAs刺激：1 μg/mL的ionomycin（Sigma, #I9657）、162 nM的PMA（Sigma, #P8139）、50 nM的panobinostat（Selleckchem, LBH589）和250 ng/mL（1.4 nM）的Tat-LNP。结合使用时，Tat-LNP和PNB使用相同的浓度。

微阵列处理

在有抗逆转录病毒药物存在的情况下，对大量CD4 T细胞用感兴趣的LRAs刺激6小时和24小时后，将10,000个细胞转移到含100 μL Buffer RLT（Qiagen, #1015762）的管中，该缓冲液补充了1%的2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich, #M3148）。

细胞存放在-80°C直到进一步处理。使用RNeasy plus mini kit（Qiagen, #74181）进行RNA提取。使用GeneChip PICO Reagent Kit按照制造商的指导进行总RNA的扩增和生物素标记（ThermoFisher, #902790）。

生物素标记的目标样品在Clariom GO Screen上进行杂交（ThermoFisher, #952361），该芯片包含超过20,000个基因的探针。目标杂交在GeneTitan多通道仪器（ThermoFisher, #00-0373）上按照制造商为表达阵列板提供的指南进行。使用GeneChip Command Console（GCC）软件（v6.1.1.195; ThermoFisher）分析图像。

微阵列数据分析

微阵列数据集通过稳健多阵列分析进行背景校正和标准化，并使用ClariomSHumanHT_Hs_ENTREZG v21.0.0芯片定义文件进行总结。我们使用arrayQualityMetrics进行了质量评估。使用所有22,593个探针集的表达值，我们利用欧几里得距离矩阵来评估主要的变异源。

在二维空间中，两点（点1和点2）之间的欧几里得距离是根据点的笛卡尔坐标（x1, y1）和（x2, y2）计算的。欧几里得距离通过公式√(x1–x2)^2 + (y1–y2)^2计算得出。我们基于刺激识别了三个不同的簇：簇1（NS样本或用DMSO、HA-LNP、Tat-LNP处理的样本）；簇2（Tat-LNP/PNB和PNB）和簇3（PMA/i）。

我们使用线性回归模型（Limma）进行了微阵列数据分析（见补充数据3和4），进行了差异表达基因（DGE）分析（即，将簇2和簇3与簇1进行比较）。根据Benjamini–Hochberg校正的p值< 0.01，确定的基因被视为统计学上显著的。

我们使用ClusterProfiler（v3.16.1）（见补充数据3和4）进行了基因集富集分析（GSEA），以评估基于顺序排列的基因列表（根据log2倍数变化排列；DGE分析结果输出）上的基因集富集。根据Benjamini–Hochberg校正的p值< 0.05，确定的途径和术语被认为是统计学上显著的。

P24-SIMOA

在抗逆转录病毒药物（200 nM raltegravir和200 nM lamivudine）存在下，2至5百万CD4 T细胞分别被用LRAs刺激24小时和48小时。刺激后，收集上清并储存在-80°C，直至进一步处理。

上清在室温下解冻，使用经过验证的SIMOA p24试剂盒（Quanterix, USA）在SIMOA HD-1分析仪上测定Gag p24浓度，按照制造商的指导进行。p24浓度通过使用四参数逻辑回归曲线拟合从原始信号的平均酶每珠（AEB）计算得出。

HIV-Flow程序

按照Pardons等人8先前描述的方法，使用针对p24蛋白的两种抗体（p24 KC57-FITC和p24 28B7-APC）的组合，测量了LRA刺激后产生p24的细胞频率。HIV-Flow程序的详细协议可以在以下链接找到：https://doi.org/10.17504/protocols.io.w4efgte。

STIP-Seq的基于甲醇的HIV-Flow程序

按照Cole等人40先前描述的方法进行了基于甲醇的HIV-Flow程序。简要来说，刺激后，每种条件下最多5×10^6个细胞在PBS中重悬，并在室温下用可固定的活性染色剂510染色20分钟。

然后，细胞在PBS + 2% FBS中用针对细胞表面分子（CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD27、PD1）的抗体染色20分钟，温度为4°C。经过4°C下5分钟的离心步骤以预冷细胞后，CD4细胞被涡旋混合以避免团聚，并缓慢加入900 μL冰冷的甲醇（-20°C）。

细胞在冰上的甲醇中固定/渗透15分钟。使用两种抗体（p24 KC57-FITC和p24 28B7-APC）（45分钟，室温）在PBS/1% BSA（ThermoFisher, #AM2616）/RNAse抑制剂0.4 U/μL（Promega, #N2615）/DTT 1 mM中进行细胞内p24染色。甲醇渗透后的所有洗涤步骤都在PBS/0.04% BSA中进行。在所有实验中，均包括HIV阴性对照的CD4 T细胞以设定阳性阈值。

基于甲醇的HIV-Flow程序用于单细胞RNA测序

用于单细胞RNA测序的HIV-Flow程序与下文所述的类似，但有一些不同。所有表面和材料都使用RNAse away（ThermoFisher, #7003）清洁，以防止RNA降解。

经甲醇固定/渗透后，所有洗涤步骤都在PBS/0.04% BSA（ThermoFisher, #AM2616）/RNAse抑制剂0.2 U/μL（Promega, #N2615）/DTT 1 mM中进行。细胞在排序前重新悬浮在同一缓冲液中。所有管子在获取和排序前都保持在冰上并避免光照。

单个p24+细胞的分选

单个p24+细胞在BD FACSAria Fusion细胞分选仪上进行分选。细胞被分选到带裙边的96孔PCR板（Biorad, #12001925）中。为了避免排序过程中的蒸发，PCR板持续在4°C下冷却。

对于STIP-Seq实验，细胞被分选到4 µL PBS sc 1X（Qiagen, #150345）中。对于单细胞RNA测序实验，细胞被分选到2 µL裂解缓冲液中，该缓冲液包含0.1 µL RNAse抑制剂（Takara, #2313B）和1.9 µL 0.2%体积/体积Triton X-100（Sigma-Aldrich, #T8787）。

此外，对于每位参与者，分选了20个p24- TCM/TTM细胞和20个p24- TEM细胞。使用索引分选，这是一种记录所有单独分选细胞标记坐标的过程，以便对单独分选的p24+细胞进行表型分析。CD4 T细胞记忆亚型定义如下：TN = CD45RO- CD27+，TCM/TTM = CD45RO + CD27+，TEM = CD45RO + CD27-，TTd = CD45RO- CD27-。使用Flow-Jo软件v10.6.2（Tree-Star）分析流式细胞术数据。

多位移扩增（MDA）

使用REPLI-g单细胞试剂盒（Qiagen, #150345）按照制造商指导进行单个分选细胞的全基因组扩增，采用多位移扩增方法。每个板上都包括一个阳性对照，由10个p24-细胞分选到同一个孔中。

RPP30参考基因的定量聚合酶链反应（qPCR）

在MDA完成全基因组扩增后，根据之前的描述，使用qPCR筛查RPP30参考基因。产生38或更低循环阈值（Ct）值的反应被选定进行进一步的下游处理。

整合位点分析

对RPP30呈阳性的MDA反应进行了整合位点测序，使用了先前描述的整合位点环路放大（ISLA）测验的修改版。所得扩增子在1%琼脂糖凝胶上可视化，阳性样品通过Sanger测序进行测序。序列分析使用了“整合位点”网络工具进行。

接近全长嵌合病毒基因组扩增

对RPP30呈阳性的MDA样本进行了5'和3'半基因组扩增。第一轮25 µL PCR混合物包括：5 µL 5× Prime STAR GXL缓冲液，0.5 µL PrimeStar GXL聚合酶（Takara Bio, #R050B），0.125 µL ThermaStop（Sigma Aldrich, #TSTOP-500），250 nM正反向引物，和1 µL的1/5稀释MDA产物。第二轮混合物的组成相同，使用第一轮产物的1 µL作为输入。

第一轮和第二轮PCR的热循环条件如下：98°C 2分钟；35个循环（98°C 10秒，62°C 15秒，68°C 5分钟）；68°C 7分钟。对于没有产生5'或3'扩增子的MDA样本，使用2对引物（5'扩增子的片段1和片段2；3'扩增子的A2和B2）在第一轮产物上。不同方法的引物序列总结在补充表4中。所进行的所有PCR的总结显示在补充数据1中。

接近全长嵌合病毒基因组测序和组装

扩增子以等摩尔比例混合并通过磁珠纯化（Ampure XP, Beckman Coulter, #A63881）清洁，然后使用Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒（Invitrogen, #P7589）进行定量。

库制备使用Nextera XT DNA库制备试剂盒（Illumina, #FC-131-1096）按照制造商指导进行，每次运行索引96个样本。库在MiSeq Illumina平台上通过2×150 nt双端测序与300周期v2试剂盒（Illumina, #MS-102-2002）进行测序，按照制造商的指导进行，每个样本产生约200,000次读取。

接近全长嵌合病毒基因组序列的de novo组装如下进行：（1）使用FastQC对FASTQ质量进行检查，并使用BBtools（v37.99, sourceforge.net/projects/bbmap/）去除Illumina接头序列和质量修剪5'和3'末端。（2）使用MEGAHIT（v1.2.9）对修剪后的读取进行de novo组装，设置为标准。

（3）使用blastn（v2.7.1）将结果拼接体与HXB2 HIV-1参考基因组进行比对，设置为标准，并保留与HXB2匹配的拼接体。（4）将修剪后的读取映射到de novo组装的HIV-1拼接体上，使用bbmap生成基于每碱基多数共识调用的最终共识序列。

嵌合病毒基因组分类

使用Proviral Sequence Annotation & Intactness Test（ProSeq-IT）（https://psd.cancer.gov/tools/tool_index.php）和洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV序列数据库的公共“Gene Cutter”和“Hypermut”网络工具进行接近全长（NFL）嵌合病毒基因组分类。

嵌合病毒基因组按以下顺序进行分类：（1）“反转”：指内部序列反转的存在，定义为反向互补区域。（2）“大内部缺失”：内部序列缺失超过1000 bp。（3）“高突变”：APOBEC-3G/3F诱导的高突变。（4）“PSI/MSD缺陷”：覆盖（部分）包装信号区或MSD处缺失GT二核苷酸，以及隐性供体位点（位于MSD下游4 bp）处缺失GT二核苷酸的删除超过7 bp。

扩展到gag基因并去除gag AUG起始密码子的PSI/MSD覆盖缺失的嵌合病毒也被归类为此类别。（5）“早终止密码子/移码”：由于突变和/或序列插入/缺失导致的gag、pol或env基因中的早终止密码子或移码。在gag中插入/缺失超过49 nt、在pol中插入/缺失超过49 nt或在env中插入/缺失超过99 nt的嵌合病毒也被归类为此类别。（6）“完整”：未显示上述缺陷的嵌合病毒被归类为此类别。

单细胞RNA测序通过Smart-seq2

将单个p24+和p24−细胞分选到2 µL的裂解缓冲液中后，96孔板被迅速冷冻于干冰上并储存在-80°C，直至进一步处理。板子解冻后，通过Smart-seq2生成了扩增cDNA，这与Picelli等人的描述类似，但有所调整。

为了尽量减少引物二聚体和/或其他连锁体的形成，将oligo-dT的浓度降低了十倍，从10 µM降至1 µM。这一修改消除了所有连锁体，同时保持了文库的复杂性。在cDNA生成后，进行了24个周期的预扩增，以生成足够的产量进行文库制备。

使用Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina, #FC-131-1096）按照制造商的指导为每个单细胞生成文库，每次运行索引384个细胞。384个细胞的文库被等摩尔比例混合，并在Nextseq 500上通过2×150 nt的双端测序与NextSeq 500/550高输出试剂盒v2.5（300周期）（Illumina, #20024908）进行测序，每个细胞产生约1,000,000次读取。

Smart-seq2处理共产生了108个（20个TCM/TTM，88个TEM）和212个（6个TN，124个TCM/TTM，79个TEM，3个TTd）p24+细胞，分别在单独使用Tat-LNP或与PNB联合治疗后获得。每位参与者的p24+细胞中位数为Tat-LNP 14个和Tat-LNP/PNB 30个（参见补充数据2）。

同时，分别在Tat-LNP或Tat-LNP/PNB刺激后，共分选了109个（59个TCM/TTM，50个TEM）和150个（95个TCM/TTM，55个TEM）p24−细胞。每位参与者的p24−细胞中位数为Tat-LNP 20个和Tat-LNP/PNB 21个（参见补充数据2）。此外，作为阳性和阴性对照，分别分选了28个PMA/i刺激的p24+细胞和17个NS细胞。

单细胞RNA测序分析

使用FastQC评估了fastq文件的整体质量，并使用BBtools去除了Illumina接头序列并对5'和3'末端进行了质量修剪。更多关于质量控制指标的信息提供在补充表5中。修剪后的读取使用STAR aligner（v2.7.10a）对齐到人类参考基因组GRCh38/hg38。

使用Subread包（v2.0.3）中的Featurecounts功能获取了每个基因的读取计数。通过移除检测到的基因少于200个或多于4500个的细胞，以及映射到线粒体基因的读取超过20%的细胞，对低质量细胞进行了过滤。

原始读取计数通过ln（CPM + 1）转换进行读取深度标准化，并使用Seurat（v4.1.0）包在R（v4.2.0）中进行了UMAP降维。使用标准化读取计数，利用R中的MAST（v1.20.0）算法推断差异表达基因（DEG）。p值来源于似然比测试。经Bonferroni校正后小于0.05的p值被认为显著。

通路富集分析

使用R中的“clusterProfiler”（v4.8.0）包进行GSEA。基因本体基因集从MsigD70下载，而来自WikiPathways、Reactome、KEGG、PID和BioCarta数据库的典型通路基因集被组合在一起。从分析中排除了大小小于20或大于500基因的基因集。

使用log2（倍数变化）的排序列表作为clusterProfiler包的“GSEA”函数的输入。然后，使用“enrichplot”（v1.20.0）R包的“dotplot”功能可视化了25个最显著的通路（按校正后的p值排序）。Seurat R包中的AddModuleScore函数用于为每个单细胞分配感兴趣的每个基因集的得分。

在基于平均表达量将所有基因分为n = 20个组后，为基因集中的每个基因从同一组中随机抽取n = 100个对照基因。从每个单细胞的每个基因集的平均表达水平中减去对照基因的平均表达水平。

单细胞RNA测序数据中的病毒基因组组装

对于de novo组装，对每个HIV-1感染细胞的RNA测序读取进行了修剪，并使用STAR aligner（v2.7.10a）映射到人类参考基因组GRCh38/hg38，以去除宿主来源的读取。

这些去除宿主的读取使用MEGAHIT（v1.2.9）进行de novo组装，设置为标准。所得拼接体使用blastn（v2.7.1）对齐到HXB2 HIV-1参考基因组，设置为标准，保留与HXB2匹配的拼接体。

修剪的去除宿主的读取映射到de novo组装的HIV-1拼接体上，使用bbmap生成基于每个碱基多数共识调用的最终共识序列。

对于每位参与者，使用MAFFT（v7.471）将STIP-Seq嵌合病毒（如果可用）和RNA测序病毒对齐到HXB2。

这些对齐手动检查并按以下顺序分类为克隆：1）RNA测序病毒与STIP-Seq嵌合病毒100%相同，2）如果RNA测序病毒序列覆盖不完整，RNA测序病毒跨越与STIP-Seq嵌合病毒中相同的缺失连接位点，以及3）RNA测序病毒与STIP-Seq嵌合病毒不匹配，但在RNA测序数据中是100%相同或跨越相同的缺失连接位点被标记为相同序列的扩展（EIS）。

为了构建系统发育树，使用MAFFT（v7.471）对齐了完全覆盖的STIP-Seq和RNA测序序列。系统发育树使用PhyML v3.072（NNI和SPR重排的最佳选择）和1000次自举构建。为了更清晰，属于克隆的序列每次实验只包括一次。

脚本关于从RNA测序数据中de novo组装HIV-1基因组将在本稿件被接受后上传到GitHub。

HIV剪接位点分析

HIV-1感染细胞的修剪、去除宿主的RNA测序读取使用STAR aligner（v2.7.10a）映射到其各自构建的RNA测序病毒上。如果细胞被识别为感染细胞克隆的一部分，将使用最完整的de novo RNA-Seq病毒作为参考。

使用STAR在Geneious（v2020.2）中检测每个细胞中的剪接连接点，并对它们进行检查和手动注释。我们的分析重点是检测主要剪接供体位点（MSD，D1）的替代供体位点，因为在从p24+细胞中恢复的大多数嵌合病毒基因组中，MSD被突变或删除。图4C显示了HIV-1嵌合病毒用来剪接到已知受体位点（A1-5）的5' UTR区域的剪接供体位点。

评估体外感染后LINC02964表达

使用CD4 MicroBeads（Miltenyi Biotec, #130-045-101）阳性分离三名HIV-供者的CD4 T细胞，并在RPMI + 10%胎牛血清 + 20 ng/ml人IL-2（PeproTech, #200-02-250UG）中重悬，细胞浓度为1x10^6细胞/mL。

在感染HIV-1菌株89.6（NIH HIV试剂计划，艾滋病司，NIAID，#ARP-3552）之前，使用抗CD3/CD28珠子（1:100稀释，Miltenyi Biotec, #130-111-160）刺激CD4 T细胞2天，感染倍数为1。

每位供者的感染都进行了三次重复。使用InnuPREP RNA mini kit 2.0（#845-KS-2040250）按照制造商的指导提取RNA。使用Nanodrop™ 2000（ThermoFischer Scientific）测量RNA浓度，并在反转录反应中使用qScript cDNA Supermix（Quantabio, #95048-500）按照制造商的协议使用200 ng总RNA。

对合成的cDNA进行双重qPCR，以评估LINC02964和四个参考基因（ACTB，GAPDH，β2M，YHWAZ）的表达。PCR混合物的组成如下：250 nM正反向引物，2.5 µL LightCycler480 SYBR Green I Master（Roche Diagnostics, #04707516001），总反应体积为5 µL。热循环条件如下（LightCyler 480；Roche Applied Science）：95°C 5分钟；

45个循环（95°C 10秒，60°C 15秒，72°C 15秒）；从60°C到95°C的熔解曲线和40°C 1分钟的冷却。使用qbasePLUS软件（Biogazelle，比利时）计算了归一化的相对数量（NRQs），并根据每位供者相应的未感染对照样本进行了缩放。

评估潜伏感染SupT1细胞中LINC02964的表达

SupT1细胞（来自NIH试剂计划，#ARP-100）感染了单循环NL4.3-ΔENV-IRES-HSA实验室株。通过流式细胞术评估了HSA的表面表达，每三天进行一次：感染三周后，p24+细胞的百分比从44.7%降至2%。

潜伏感染的SupT1细胞在抗体序列1/2/3（ASOs 1/2/3）（1 µM）和非靶向对照ASO（NTC）中孵育了2天。然后，细胞被Tat-LNP（250 ng/mL; 1.4 nM）刺激或未刺激。在过夜刺激后，我们通过流式细胞术评估了表达HSA的细胞比例，并如上所述通过RT-qPCR验证了LINC02964表达的下调。LINC02964表达水平（NRQs）被调整到模拟条件。进行了两个独立实验，并在每种条件下进行了两个技术重复。

数据表示和统计分析

使用Graphpad Prism（v8.0.2）生成条形图和折线图。在R（v4.1.1）中使用ggplot2包（v3.3.5）和ggforce包（v0.3.3）的“geom_sina”函数生成小提琴图。补充图5A上的相关矩阵在R（v3.6.1）中使用stats包（v4.0.2）的“dist”函数以及ComplexHeatmap包（v2.4.3）生成。

补充图5B上的基因本体热图在R（v3.6.1）中使用ComplexHeatmap包（v2.4.3）生成。补充图6B上的热图在R（v4.2.0）中使用dittoSeq包（v1.8.1）的dittoHeatmap函数生成。图4A上的系统发育树在R（v4.1.1）中使用ggtree（v3.2.1），ape（v5.6）和phytools（v1.0-1）包可视化。

两个配对组之间的中位数倍数诱导是通过计算每位参与者的倍数诱导并报告这些倍数诱导的中位数来获得的（图1）。对于相关性测试，计算了Spearman等级相关系数（图8B，补充图4B，C）。对于配对组比较，使用双侧非参数Wilcoxon测试。

对于非配对组比较，使用双侧非参数Mann-Whitney测试。对于具有不等方差但正态分布的组间比较，使用Games-Howell测试，随后进行Bonferroni多重比较校正。为了生成补充图4B，C，使用z分数（标准分数）对p24抗体荧光强度和HIV读取的百分比进行了归一化。小于或等于0.05的P值被认为是统计显著的。

结合使用PNB的Tat-LNP比PMA/i在更多细胞中诱导HIV潜伏期逆转

为了找到最佳的激活时间点，我们对四名接受ART治疗的患者的CD4 T细胞进行了24小时或48小时的Tat-LNP（250 ng/mL）和PNB（50 nM）单独或联合刺激（Tat-LNP/PNB）。

作为阳性对照，我们使用了PMA/i（162 nM/1 μg/mL）的24小时刺激。此外，包括了三种阴性对照：未刺激的细胞（NS），DMSO，以及含有流感病毒血凝素肽的脂质纳米粒子（HA-LNP）。我们通过HIV-Flow实验和超敏感p24-SIMOA来评估细胞内p24蛋白产生和病毒颗粒释放的情况。

Tat-LNP在两个测试时间点都没有引起细胞死亡，显示出该配方无细胞毒性。在阴性对照组（NS，DMSO，HA-LNP）中，我们没有检测到p24阳性细胞。而PNB在刺激后24小时和48小时均诱导了低水平或无HIV激活（中位频率为0.3个p24阳性细胞/106个CD4 T细胞）。

相比之下，在24小时后的Tat-LNP处理中，2/4个受试者的p24阳性细胞频率较高（中位倍数诱导=0.8），而在48小时后的4/4个受试者中则观察到更高的频率（中位倍数诱导=1.8）。

在Tat-LNP和PNB组合处理24小时后观察到最高水平的激活（中位频率为18.1个p24阳性细胞/106个CD4 T细胞），与PMA/i相比，中位倍数诱导为3.2。这种组合引起的细胞死亡较少（Tat-LNP/PNB的中位存活率为73.4%，NS为84.9%）。

但在48小时后，Tat-LNP/PNB条件下的p24阳性细胞频率显著下降（中位频率为9.3个p24阳性细胞/106个CD4 T细胞），这可能部分由于此时较低的细胞存活率（Tat-LNP/PNB的中位存活率为53.1%，NS为77%）。

通过p24-SIMOA对培养上清中病毒颗粒的释放进行的评估也证实了这些结果，显示在Tat-LNP/PNB条件下相对于PMA/i在24小时和48小时后刺激时观察到最高的倍数诱导（24小时后为1.4倍，48小时后为15.2倍）。

由于Tat-LNP/PNB在刺激后24小时显示出最高的HIV激活水平，我们在更大一组接受ART治疗的个体（22人，详见补充表1）的CD4 T细胞上应用了这种组合，比较了其激活效果与PMA/i的效果。

我们发现，在Tat-LNP/PNB处理条件下，p24阳性细胞的频率显著高于PMA/i处理（p < 0.00001，中位频率分别为0.9和4.1个p24阳性细胞/106个CD4 T细胞），中位倍数增加了3.9倍。使用Tat-LNP/PNB刺激四名接受ART治疗的个体的CD4 T细胞，在HIV-Flow实验中得到了可重复的测量结果（4-6次独立实验，平均变异系数为0.21）。

值得注意的是，尽管在Tat-LNP/PNB条件下的p24阳性细胞频率高于PMA/i，但通过两种p24抗体的中位荧光强度（MFI）评估，每个细胞内p24的产生量在PMA/i刺激的细胞中倾向于更高（Tat-LNP/PNB和PMA/i的中位MFI APC分别为1067和1762，中位MFI FITC分别为2837和4654）。

总的来说，我们的研究显示Tat-LNP能够有效地从潜伏期重新激活HIV，同时对细胞存活率的影响极小。此外，当Tat-LNP与PNB结合使用时，我们观察到p24阳性细胞和病毒释放的频率最高，这表明这两种化合物在诱导潜伏期逆转方面存在协同效应。

Tat-LNP/PNB刺激的p24阳性细胞表达低水平的CD4，并且在效应记忆细胞亚群中富集

首先，我们研究了对Tat-LNP和PNB的T细胞激活反应。Tat-LNP没有引起细胞表面激活标志物的上调，这可以从CD69、CD25和HLA-DR表达的稳定性中得到证明（参见补充图2A）。然而，与之前的研究一致，PNB诱导了与未刺激条件相比CD69的上调（平均MFI分别为661.3和86.0），而CD25和HLA-DR的水平则保持不变（参见补充图2B）。

虽然PNB刺激会导致CD69上调，但Tat-LNP/PNB处理保持了大量CD4 T细胞及其亚群中的CD4表达（详见补充图2C）。这使得我们能够评估潜伏期逆转后p24阳性细胞表面的CD4表达情况：与p24阴性细胞相比，p24阳性细胞的CD4表达显著降低（p = 0.0002，中位MFI分别为70和3426），这很可能是由于病毒蛋白Nef的活动。

我们还分析了Tat-LNP/PNB刺激后p24阳性细胞的记忆表型（图2C）。Tat-LNP/PNB刺激的p24阳性细胞在效应记忆亚群（TEM；p = 0.001）中显著富集，这与先前在PMA/i刺激下的描述相符。相比之下，只有少量的p24阳性细胞表现出天真（TN）或终末分化（TTd）的表型（图2C）。

我们还比较了Tat-LNP/PNB条件与PMA/i处理下p24阳性细胞的表型（图2D，补充图2B）。虽然两种刺激条件下分析的各个亚群之间没有显著差异，但在Tat-LNP/PNB条件下，p24阳性细胞呈现中心/过渡记忆表型（TCM/TTM）的趋势相比于PMA/i条件更明显（8名参与者中的6名，p = 0.148），这暗示不同类型的LRAs可能倾向于在具有不同表型的感染细胞中诱导潜伏期逆转。

值得注意的是，在记忆亚群中对CD69表达的评估表明，在未受刺激情况下，TCM亚群中的CD69表达水平低于TEM亚群（平均MFI分别为99.8和131.8）。然而，在PNB刺激后，TCM亚群相比于TEM亚群中的CD69表达水平更高，且相对于未刺激情况的倍数增加也更大（平均MFI分别为853.5和731，平均倍数增加分别为9.0和5.5）（补充图2D，E）。

PNB在TCM亚群中促进CD69表达的效果大于TEM亚群，可能部分解释了在Tat-LNP/PNB刺激后，观察到的p24阳性细胞中具有TCM表型的趋势。

Tat-LNP/PNB激活的HIV-1嵌合病毒大多与PMA/i提取的相重叠

我们使用了最新开发的STIP-Seq技术，该技术可以同时评估单个分选的p24阳性细胞中的整合位点（IS）和近全长（NFL）嵌合病毒序列，来比较使用Tat-LNP/PNB和PMA/i激活的HIV-1嵌合病毒（见补充图3和补充数据1）。在分析的5位参与者中，我们共获得了173个NFL序列。

正如之前的研究所显示的，我们观察到大多数具有翻译能力的嵌合病毒表现出包装信号（PSI）和/或主要剪接供体（MSD）缺陷（157/173，90.8%），而只有少数是基因组完整的（16/173，9.2%）（见图3A和补充数据1）。

未观察到其他缺陷，如倒位、大的内部缺失、超突变和移码突变。此外，PMA/i（n = 64）或Tat-LNP/PNB刺激条件下（n = 109）基因组完整或PSI/MSD缺陷嵌合病毒的比例没有显著差异（完整：分别为PMA/i和Tat-LNP/PNB的9.4%和9.2%，PSI/MSD缺陷：分别为90.6%和90.8%；见图3A和补充数据1）。

IS分析显示，大部分克隆（通过我们的研究和Cole等人的研究中观察到的重复相同的IS或NFL序列定义）在PMA/i条件下被检索到的，也在Tat-LNP/PNB条件下被检索到（在MRC01中4/5，MRC04中4/5，MRC08中3/4，MRC15中1/1，STAR10中1/2）（见图3）。

值得注意的是，某些感染的克隆群体似乎在两种条件中的一种被过度代表（例如MRC01中的MLLT3和ERGIC2，MRC08中的SCML4），这表明不同的LRAs可能倾向于优先激活特定的HIV感染克隆而非其他。此外，一些在PMA/i条件下未检测到的小克隆在Tat-LNP/PNB刺激的细胞中被检索到（MRC04中+5，MRC08中+1，MRC15中+1，STAR10中+3）（见图3B）。

通过对p24阳性细胞进行单细胞RNA测序，我们能够研究病毒转录本和剪接位点。我们对基于甲醇固定和渗透的STIP-Seq技术进行了一些修改，使其能与下游的单细胞RNA测序（scRNA-seq）兼容，此过程使用了Smart-seq2方法（参见方法部分）。

根据之前确定的最优激活条件（见图1B），我们对接受ART治疗的个体的CD4 T细胞进行了24小时的Tat-LNP/PNB（7个个体）和PMA/i（2个个体）刺激，以及48小时的仅Tat-LNP刺激（5个个体），然后进行了单细胞分选和Smart-seq2处理。这产生了共计108和212个p24阳性细胞，以及109和150个p24阴性细胞，分别在仅Tat-LNP或与PNB结合的处理后（见补充数据2）。

此外，我们还分选了28个PMA/i刺激的p24阳性细胞和17个NS细胞作为阳性和阴性对照。批量CD4 T细胞中的总HIV DNA测量（通过数字PCR评估）和仅Tat-LNP或与PNB结合治疗后p24阳性细胞的频率（通过HIV-Flow检测评估）见补充表2。

正如预期，我们在Tat-LNP或Tat-LNP/PNB刺激后的p24阴性细胞中未检测到HIV转录本（见补充图4A）。在p24阳性细胞中，与仅Tat-LNP刺激的细胞相比，映射到参考HXB2的读数比例在Tat-LNP/PNB条件下更高（p = 7.4e−9，中位数为Tat-LNP/PNB的15.0%和仅Tat-LNP的6.7%；见补充图4A），表明与仅Tat-LNP相比，Tat-LNP与PNB的组合诱导了更高水平的HIV转录。

有趣的是，当分析三种治疗条件（Tat-LNP，Tat-LNP/PNB，PMA/i）下获得的所有p24阳性细胞时，与TCM/TTM亚群相比，TEM亚群中HIV读数的比例显著更高（p = 0.04；见补充图4B），这与更分化的亚群中DNA更易接触相符合。

HIV转录水平（由映射到HIV的读数的归一化百分比定义）也与每个细胞内p24蛋白产生量正相关（由p24抗体的归一化MFI定义）（p = 5.1e−12对于p24 APC和p = 1.5e−10对于p24 FITC；见补充图4C）。

通过重新组装病毒读数，我们在46.5%的含有HIV转录本的p24阳性细胞中获得了病毒基因组的完整覆盖（见补充数据2）。我们构建了一个最大似然系统发育树，仅包含STIP-Seq和Smart-seq2中完全覆盖的病毒序列，从而展示了这两种技术都能检索到相同的病毒序列（见图4A）。

值得注意的是，Smart-seq2方法识别出了那些因为5'引物结合位点的缺失或突变而无法被STIP-Seq完全检索到的病毒（例如，MRC01中RPN2的整合位点的嵌合病毒）。此外，单细胞RNA测序依赖于多聚A尾部捕获而非HIV特异性引物，这使得它能够检索任何亚型的病毒序列，这是相比STIP-Seq的一个额外优势（例如，MRC03的F1亚型，见补充表1）。

基于整个基因组长度上相同的嵌合病毒最有可能来源于同一个克隆感染细胞群体这一原理，我们根据STIP-Seq检索到的整合位点推断了Smart-seq2病毒序列的整合位点，并展示了在Tat-LNP/PNB刺激后，两种检测方法检索到的感染克隆细胞群体的比例大致相同，表明这两种方法之间没有抽样偏差（见图4B）。

我们通过分析5' UTR区域中的供体剪接位点，展示了具有缺陷的MSD（D1）/隐性供体（CD; D1c）位点的可诱导嵌合病毒可以使用位于MSD/CD上游或下游的替代供体剪接位点（见图4C）。这一观察说明，MSD缺陷的嵌合病毒能够轻松地产生剪接转录本，这些转录本可以翻译成病毒蛋白如Nef，导致p24阳性细胞观察到的CD4下调（见图2A，B）。

Tat-LNP不会改变CD4 T细胞的转录组

为了评估Tat-LNP单独或与PNB结合对细胞转录组的影响，我们对来自四名接受ART治疗的个体的批量CD4 T细胞进行了Tat-LNP和Tat-LNP/PNB以及它们各自的对照组（NS，DMSO，HA-LNP和PMA/i）的刺激实验。

为了捕捉对这些化合物的即刻细胞反应和初始信号事件，细胞被刺激了6小时。通过微阵列基因表达分析、降维和无监督聚类，我们发现了三个不同的簇：簇1包括NS，DMSO，HA-LNP和Tat-LNP刺激的细胞；簇2包括PNB和Tat-LNP/PNB刺激的细胞；簇3是PMA/i刺激的细胞（见补充图5A）。这些结果表明，Tat-LNP单独对CD4 T细胞的转录组几乎没有影响。

簇2（PNB和Tat-LNP/PNB）与簇1相比调节了6018个基因的表达（校正p值< 0.01），上调的基因主要涉及细胞周期和核糖体相关途径（见补充图5B和补充数据3）。

簇3（PMA/i处理）与簇1相比改变了6661个基因的表达（校正p值< 0.01），上调的基因与核糖体相关途径、细胞因子反应、白细胞分化调节和T细胞激活有关（见补充图5B和补充数据3）。对这些化合物的长时间暴露（24小时）产生了类似的结果（见补充数据4）。

P24阳性细胞与P24阴性细胞相比显示出不同的转录组特性

鉴于Tat-LNP不显著改变CD4 T细胞的转录组，我们采用了单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法来比较携带能进行翻译的嵌合病毒的CD4 T细胞与未感染的CD4 T细胞的转录组景观。

由于大多数p24阳性细胞表现出CD45RO+记忆表型（见图2C），我们使用来自同一参与者的记忆p24阴性细胞作为对照组，以避免在分析中产生偏差。值得一提的是，为了减少技术上的变异，p24阴性和p24阳性细胞的分选、Smart-seq2处理、文库制备和测序是同时为每位参与者进行的。

根据刺激情况，分选细胞形成了三个不同的簇，与批量CD4 T细胞的微阵列数据一致（见补充图5A）。Tat-LNP刺激的细胞与未刺激（NS）细胞聚在一起，这进一步证实Tat-LNP不改变CD4 T细胞的转录组，而PMA/i和Tat-LNP/PNB处理的细胞各自形成了不同的簇。

每个细胞检测到的基因中位数在PMA/i条件下最高，其次是Tat-LNP/PNB刺激的细胞（分别为NS、Tat-LNP、Tat-LNP/PNB、PMA/i的中位数为1537≈1514 < 1821 < 2306个基因/细胞；见补充图6A），这可能是因为Tat-LNP/PNB和PMA/i显著改变了CD4 T细胞中许多基因的表达（见图5A）。

在Tat-LNP/PNB簇中，p24阳性和p24阴性细胞聚在一起（见图5B），这两组之间只有10个转录本有显著差异表达，其中最显著的是长非编码RNA（lncRNA）LINC02964（校正p < 0.05；见补充数据5）。

由于PNB对细胞转录组的显著影响可能掩盖了p24阳性和p24阴性细胞之间的差异，我们将差异基因表达（DGE）分析集中在仅Tat-LNP刺激后获得的p24阳性和p24阴性细胞上。无监督聚类部分将细胞分为对应于p24阴性和p24阳性细胞的两组（见补充图6B）。

值得一提的是，p24阳性和p24阴性细胞之间的不完美分离进一步反映了这两个细胞群体之间的高相似性，只观察到有限的差异表达基因（DEG）。我们鉴定了82个在p24阳性和p24阴性细胞之间表达水平显著不同的基因（校正p < 0.05；见补充数据5）。在最具差异性表达的基因中，我们鉴定出p24阳性细胞中LINC02964、SOD1P3、CCL5和GZMA的上调，而ATG10和IL7R在p24阳性细胞中相比于p24阴性细胞下调（见图5C）。

据我们所知，LINC02964和SOD1P3尚未有报道显示为HIV-1储库细胞中携带可诱导嵌合病毒的首选表达。细胞毒性T细胞基因如GZMA和CCL5最近被证实在HIV感染细胞中上调，无论是在病毒血症还是ART抑制个体中都是如此（见补充表3）。此外，ATG10和IL7/IL7R轴通过在细胞存活和细胞死亡中发挥核心作用，可能有利于HIV储库细胞的长期存活。

为了确定在Tat-LNP刺激后p24阳性和p24阴性细胞之间差异表达的基因集，我们进行了基因集富集分析（GSEA）。我们发现磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）信号在p24阳性细胞中上调，而与蛋白质翻译相关的基因集（包括氨基酸代谢、核糖体生物生成和组装、翻译的启动和延长）在p24阳性细胞中相比于p24阴性细胞下调（见图6A和补充数据6）。

值得注意的是，这两个途径在所有五名参与者的p24阳性和p24阴性细胞中都一致地上/下调（见图6B和C），这突显了它们在HIV感染中的潜在重要性。p24阳性细胞中PI3K/Akt信号的增强，以及蛋白质翻译的下调，可能有助于HIV感染细胞的长期存活，通过促进细胞存活和潜伏期的维持。

p24阳性和p24阴性细胞之间的转录组差异在蛋白水平上得到了证实

我们接下来探究了是否可以通过流式细胞术在蛋白水平上验证转录组发现的结果。7名接受ART治疗的个体的CD4 T细胞经过Tat-LNP刺激48小时后，我们使用HIV-Flow检测8评估了p24阳性和p24阴性细胞分组中GZMA，GZMB，IL7R和CCL5的蛋白表达水平。

Tat-LNP刺激并未改变这些感兴趣蛋白（CD45RO，CD27，GZMA，GZMB，IL7R，CCL5）的表达水平（见补充图7A）。表达GZMA和GZMB的CD4 T细胞百分比随着它们的分化阶段逐渐增加，TN细胞表达最少，而TTd细胞表达最多（中位数分别为TN，TCM/TTM，TEM，TTd的GZMA+细胞为1%，5%，35%，61%，GZMB+细胞为0.1%，0.1%，19%，52%；见补充图7B，C）。

值得一提的是，7名接受ART治疗的参与者中，表达GZMA/GZMB的TEM细胞比例变化较大（GZMA为13-72%，GZMB为0.1-61%），这表明除了表型以外的因素可能也会影响颗粒酶的表达水平。

在CD4 T细胞中，与p24阴性细胞相比，更多的p24阳性细胞表达GZMA（p = 0.02；见图7A和补充图7D）。当在TCM/TTM和TEM亚群分别进行分析时，也观察到了相同的趋势（TCM/TTM的p = 0.03和TEM的p = 0.08；见图7A）。

与此相反，与p24阴性细胞相比，p24阳性细胞中表达GZMB的比例较低，无论是在TCM/TTM亚群还是在TEM亚群中（TCM/TTM和TEM的p = 0.02；见图7B和补充图7D）。

此外，在所有分析的亚群中，IL7R在p24阳性细胞中的表达显著低于p24阴性细胞（CD4 T细胞、TCM/TTM和TEM的p = 0.02；见图7C和补充图7D），而CCL5在p24阳性细胞组中的表达相比于p24阴性细胞在总体CD4 T细胞和TCM/TTM亚群中增加（分别为p = 0.03和p = 0.02；见图7D和补充图7D）。

总的来说，我们的研究发现GZMA、IL7R和CCL5在p24阴性和p24阳性细胞之间在蛋白水平上有差异表达，这与我们的转录组数据相符。

评估LINC02964在HIV-1感染和潜伏期逆转中的作用

为了确认LINC02964在HIV-1病理过程中的潜在作用，我们比较了未感染CD4 T细胞与体外用HIV-1病毒株89.6感染的CD4 T细胞中这一转录本的表达（3名HIV阴性供体）。

在体外感染后，与未感染样本相比，这一转录本在所有测试的时间点上都有上调（所有时间点综合考虑的中位倍数诱导为6.4）（见图8A），并且与每个感染样本中p24阳性细胞的百分比密切相关（p < 0.0001）（见图8B）。

此外，我们从三名病毒血症患者中分选了p24阴性和p24阳性细胞，并在这两个群体中测量了LINC02964的表达：与p24阴性细胞相比，p24阳性细胞中LINC02964的表达平均高出141倍，这证实了活跃的HIV感染与LINC02964表达的上调有关（见图8C）。

为了评估LINC02964敲减对活跃感染的影响，我们将3名HIV阴性供体的CD4 T细胞在体外感染HIV-1病毒株89.6之前与五种反义寡核苷酸（ASOs）孵育（见图8D和E）。

在5种ASOs中的3种（ASO 1/2/3）中，与非靶向对照ASO（NTC）相比，LINC02964的表达下降了至少50%（见图8D）。随着ASOs 1-3使LINC02964的表达下调，与NTC相比，p24阳性细胞的百分比也减少了（NTC的平均为6.1%的p24阳性细胞，ASOs 1、2和3分别为2.3%，1.6%和2.8%的p24阳性细胞），这表明LINC02964可能促进了活跃的HIV感染（见图8E）。

最后，为了研究LINC02964在潜伏期逆转中的作用，我们开发了一种稳定的SupT1细胞系，携带潜伏的单轮NL4.3-ΔENV-IRES-HSA。

尽管在Tat-LNP刺激前用ASOs 1/2/3孵育细胞导致LINC02964的表达下降（见图8F），但ASO处理并未对潜伏期逆转产生影响，与模拟条件相比没有差异（模拟条件下平均为18.8%的HSA阳性细胞，ASOs 1–3分别为18.8%，19.3%，19.7%的HSA阳性细胞）（见图8G）。

这一发现表明，尽管LINC02964似乎参与了活跃的HIV感染，但它在HIV激活中似乎不起作用。

据我们所知，我们是首个报道了一种LRA（潜伏期逆转剂）组合，能在更高比例的潜伏期感染细胞中诱导潜伏期逆转，超过了传统的有丝分裂原。

Tat-LNP/PNB的高反应能力可能源于这两种分子不同的作用机制：PNB通过打开染色质促进HIV转录的早期阶段，而Tat通过招募P-TEFb复合体到LTR32来促进延伸阶段。通过SIMOA测量培养上清中的p24浓度证实了Tat-LNP/PNB也能在上清中有效释放病毒颗粒，这在临床环境中尤为重要。

在比较PMA/i和Tat-LNP/PNB刺激的p24阳性细胞的记忆表型时，Tat-LNP/PNB条件下倾向于有更多的TCM/TTM表型p24阳性细胞，这表明结合LRA和HDACi可能有利于激活潜伏在表现TCM表型CD4 T细胞中的潜伏嵌合病毒，正如之前研究所述52。

通过使用STIP-Seq检测，我们展示了：（i）在Tat-LNP/PNB和PMA/i激活的p24阳性细胞中，完整和PSI/MSD缺陷嵌合病毒的比例相似，约90%的嵌合病毒是PSI/MSD缺陷，10%是完整的，

（ii）在PMA/i刺激后观察到的主要感染克隆也在Tat-LNP/PNB条件下被检索到，但一些罕见和次要克隆仅在其中一种条件下被检索到。与先前研究一致，我们显示MSD缺陷的嵌合病毒可以使用替代剪接位点产生剪接转录本。

尽管MSD存在缺陷，Nef的有效产生可以解释为何携带MSD缺陷嵌合病毒的p24阳性细胞观察到CD4下调。然而，最近的证据表明，由于Env产生减少，PSI/MSD缺陷的嵌合病毒传染性有限，表明它们不太可能在ART中断后导致病毒反弹。

尽管如此，这些嵌合病毒可能是ART治疗者中不可抑制的病毒血症的来源，并且通过产生病毒蛋白参与慢性免疫激活，这进一步强调了对携带PSI/MSD缺陷嵌合病毒的储库细胞进行详细表征的必要性。

此外，我们证明了Tat-LNP不改变CD4 T细胞的转录组。利用这一特性，我们比较了Tat-LNP刺激后p24阳性细胞与其p24阴性对应体的转录组特征。虽然之前的单细胞RNA测序研究比较了能翻译的储库细胞的转录组与未感染的大量CD4细胞，但我们考虑到大多数p24阳性细胞表现出CD45RO+记忆表型，并将p24阳性细胞的转录组与其记忆p24阴性对应体进行了比较。

这一点，加上使用保持CD4 T细胞转录组不变的化合物，可能解释了我们的分析中获得的差异表达基因（DEG）数量较少但可能更为相关，与之前的研究相比。在最显著差异表达的基因中，我们发现LINC02964、SOD1P3、CCL5和GZMA在p24阳性细胞中上调，而ATG10和IL7R在p24阳性细胞中相比于p24阴性细胞下调。

为了提供背景，补充表3提供了最新的scRNA-seq研究对HIV感染细胞表型的全面回顾。如表所示，与我们的观察一致，先前的研究表明，在HIV病毒血症个体中，与HIV-1 RNA- T细胞克隆相比，HIV-1 RNA+ T细胞克隆中的细胞毒性T细胞基因如GZMA和CCL5上调，以及在接受ART治疗的个体中携带完整HIV嵌合病毒的克隆中。

健康人血液中检测到的细胞毒性CD4 T细胞表达高水平的抗凋亡分子Bcl-256，表明细胞毒性CD4 T细胞可能具有有利于其长期存活的特性。我们发现p24阳性和p24阴性细胞之间IL7R和ATG10表达差异，这两种分子参与细胞存活途径。

基因集富集分析进一步证实了这些观察，显示了p24阳性细胞中PI3K信号途径的上调，这是直接涉及细胞存活、代谢和增殖的途径。我们还展示了与蛋白质翻译相关的基因集在p24阳性细胞中下调，这可能通过限制病毒颗粒的产生来保护HIV感染细胞免遭免疫清除。

这些结果与最近的一项研究一致，该研究表明在HIV感染的记忆CD4 T细胞中存在HIV沉默和细胞存活特征。需要进一步研究确定这些特征是由HIV激活引起的还是反映了赋予细胞长期存活优势的独特特性。

最后，我们在蛋白水平上证实了通过Smart-seq2观察到的转录组差异。与Collora等人最近的研究不同，该研究比较了PMA/i刺激后p24阳性和p24阴性细胞的表型，我们并未观察到p24阳性细胞组中相比于p24阴性细胞有GZMB表达的增加。

使用不同的LRAs来激活HIV，例如PMA/i与Tat-LNP，可能解释了这种差异，并强调了使用不改变细胞表型的LRAs的重要性。我们通过显示这一转录本在对初级CD4 T细胞的体外HIV感染的反应中上调，证实了LINC02964的功能相关性。

此外，这一转录本在病毒血症个体中的p24阳性细胞中的表达量比p24阴性细胞高出约140倍，进一步支持了体外获得的数据。使用反义寡核苷酸成功降低LINC02964的表达，导致体外感染的CD4 T细胞中p24阳性细胞百分比的减少，表明LINC02964可能促进活跃的HIV感染。

然而，LINC02964在潜伏期逆转中似乎没有作用。需要更多研究来确定这种lncRNA在HIV病理过程中的确切角色，并阐明其分子作用机制。

总的来说，Tat-LNP单独或与其他保持细胞表型的LRAs结合使用，是体外储库研究的宝贵工具，因为它使得可以表征大量HIV储库细胞的转录组景观和蛋白质组，且接近其近原生状态，可能有助于发现新的药物靶标。

尽管我们的FACS分析仅限于少量蛋白质，未来研究应包括质谱细胞术或多色FACS，这允许同时分析超过30个标记。最后，未来的临床前研究需要在人化小鼠和/或非人灵长类动物模型中进行，以评估体内生物安全性，并确认Tat-LNP治疗后的潜伏期逆转能力和随后储库规模的减小。

注释：

HIV-1: 指人类免疫缺陷病毒第一型，这是导致获得性免疫缺陷综合症（AIDS）的病毒。

Tat-LNP: 这是一种研究中使用的特殊脂质纳米粒子，含有Tat mRNA。Tat是HIV病毒的一个蛋白质，而LNP代表脂质纳米粒子。

RNA-seq: RNA测序，一种用于研究细胞内RNA（核糖核酸）分子的高通量测序技术。

CD4 T细胞: 一类免疫系统的细胞，对HIV感染非常关键。HIV病毒主要通过感染这种细胞来破坏人体的免疫系统。

LINC02964: 一种特定的长非编码RNA（lncRNA），在这项研究中发现其在HIV感染细胞中的表达增加。

ASOs: 抗体序列（Antisense Oligonucleotides），一种可以影响RNA活动的小分子，用于基因沉默或调控。

NTC: 非靶向对照（Non-Targeting Control），在实验中用作对照组，以确保结果的准确性。