研究发现：基因编辑技术CRISPR-Cas有望彻底治愈HIV，但可能导致细胞癌变
发布日期：2024-01-10
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本文原名” CRISPR-Cas对HIV-1质粒DNA的攻击可能导致周围细胞DNA的意外删除“，作者为刘晔（音译）、Caroline S. Binda等人。文章2023年11月20发表在《Journal of Virology》，《Journal of Virology》（病毒学杂志）是由美国微生物学会（American Society for Microbiology, ASM）出版的一份国际著名的同行评审科学期刊，主要专注于病毒学领域的研究。
这篇文章主要研究了 CRISPR-Cas9 和 Cas12a 基因编辑技术在攻击 HIV 质粒 DNA 时可能产生的大范围意外删除，并探讨了这些删除的特点和潜在风险。研究发现，CRISPR-Cas 基因编辑技术不仅能引起目标位点的小范围插入和删除（indels），还可能导致更大范围的删除，包括周围染色体 DNA 序列。
这些大范围的删除通常以目标位点为起点，很可能是由靶向 Cas 切割活动引起的。研究还发现，这些大范围删除的断点连接处经常出现微同源，表明微同源介导的末端连接（MMEJ）DNA 修复机制在这些删除的形成中起作用。
此外，研究还使用了一系列实验方法，包括 Alu PCR、巢式 PCR 和测序分析，以识别 HIV 整合位点和大范围删除。最后，文中讨论了 CRISPR-Cas 治疗可能带来的风险，包括抑癌基因的丢失或原癌基因的激活，这可能导致细胞癌变，强调了在临床应用中需要对这些潜在风险进行密切监测。
近期研究发现，CRISPR-Cas 基因编辑技术能够在感染 HIV-1 的细胞中有效地关闭病毒 DNA。这种技术通过在 HIV 基因组的特定部位引入突变，主要是小范围的插入和删除，或者改变病毒 DNA 片段的排列，实现其作用。
我们为了研究这种技术对潜在感染的 T 细胞系是否也可能引起较大范围的非预期DNA删除，特别设计了一种 PCR 测序方法，该方法的引物能够结合到包围病毒 DNA 的染色体 DNA 上。
研究结果显示，CRISPR-Cas 对 HIV DNA 的持续或短暂攻击不仅引起了小范围的插入和删除，还经常导致更大的 DNA 删除，这可能影响到周围的正常细胞 DNA。对这些删除断点的分析显示，这些大范围删除是由 CRISPR-Cas 的精准攻击引发的。
在持续使用 CRISPR-Cas 的情况下，我们还发现这些断点位置经常出现小片段的相似序列，这暗示了微同源末端连接机制在形成大范围删除中起了关键作用。由于这种染色体序列的丢失可能引发细胞癌变，因此在临床上应用这种抗病毒技术时，这种非预期的大范围删除可能带来潜在的安全风险。
目前，尽管通过抗逆转录病毒治疗可以有效控制 HIV 的复制，但这种治疗并不意味着根治。因为目前的药物无法对感染细胞中已整合的 HIV-1 DNA 进行灭活，HIV 感染者需要终身接受治疗以防止病毒反弹。
多项临床前期研究表明，CRISPR-Cas 基因编辑技术有望永久性地停用病毒 DNA。早期研究表明，这种停用是由于在 HIV 基因组的特定位点引入了小范围灭活突变，以及病毒 DNA 片段在两个目标位点间的切除或倒置。
然而，我们的研究发现，CRISPR-Cas 治疗还可能引起较大范围的非预期 DNA 删除，这可能涉及到相邻的染色体序列。这种染色体序列的丢失可能导致细胞癌变，因此，在抗病毒治疗的临床应用中，这种大范围的非预期删除可能构成一个安全风险，这一点也可能适用于所有 CRISPR-Cas 基因编辑技术。
目前的抗逆转录病毒治疗方法，通过使用多种抗病毒药物，能够有效地抑制 HIV 的复制，使得病毒载量几乎无法被检测到，但这并不能根治 HIV。因为 HIV 的质粒 DNA 仍然残留在构成病毒储库的细胞中（参考文献 1-3）。
这意味着 HIV 感染者需要终身服用药物来预防病毒反弹（参考文献 4, 5）。为了消除这些病毒储库，研究人员提出了一些新的治疗策略，其中包括运用 CRISPR-Cas 基因编辑技术，靶向整合在细胞中的 HIV DNA（参考文献 6, 7）。
Cas 酶的切割作用会在 DNA 中产生双链断裂，细胞可以通过自身的 DNA 修复机制来修复这种损伤，特别是通过非同源末端连接和微同源介导的末端连接（MMEJ）（参考文献 8, 9）。
这种修复过程通常会在 Cas 切割位点引入突变，如小的插入和删除（indels），这些突变可能会灭活病毒，尤其是当它们针对病毒的关键序列时。
我们和其他研究团队已经证明，如果 T 细胞持续产生 Cas9 或 Cas12a 和单一的引导 RNA（gRNA 对于 Cas9，crRNA 对于 Cas12a），并将其靶向 HIV DNA 基因组，可以大幅抑制 HIV 在 T 细胞培养中的复制（参考文献 10, 11）。
但是，Cas 酶切后的 DNA 修复不仅引起了灭活病毒的突变，也加速了病毒逃逸，因为它产生了一些突变，这些突变阻止了 gRNA/crRNA 的结合，但并未阻止病毒的复制（参考文献 10, 12–15）。
通过使用双重 gRNA 或 crRNA 同时靶向不同的高度保守且对病毒至关重要的序列，我们实现了更持久的病毒抑制效果（参考文献 16–18）。某些 gRNA/crRNA 组合成功地完全阻止了病毒逃逸，并实现了病毒的彻底和永久性灭活。最近，我们还发现，通过重复短暂使用 Cas9 或 Cas12a 核糖核蛋白（RNP）复合物治疗，也能够灭活潜伏感染 T 细胞中的所有质粒 DNA（参考文献 19）。
无论是持续的还是短暂的双重 gRNA/crRNA 攻击，都在目标位点引起了突变，主要是小的插入和删除（indels），但也包括了目标位点之间片段的切除，以及在较小程度上的倒置（参考文献 18–20）。
值得注意的是，与 Cas9 相比，Cas12a 处理导致的切除或倒置的频率较低，这可能与它们不同的切割模式或 Cas 蛋白的动力学差异有关。例如，Cas9 切割的 DNA 末端是平整的，而 Cas12a 切割的 DNA 末端则是带有 5´ 悬垂的粘性末端（参考文献 21）。
CRISPR-Cas 引发的突变一般通过先对目标 DNA 进行 PCR 扩增，然后对扩增产物进行测序的方式来检测（参考文献 16）。在这一过程中，研究人员使用能够与病毒 DNA 目标位点的上游和下游结合的 PCR 引物来扩增目标 DNA 区域，这样就可以检测出预期的突变。
但是，如果发生的删除超出了这些引物的定位范围，这些较大的删除就无法被检测到。特别是，如果这些大范围的删除扩展到了质粒 HIV DNA 周围的染色体 DNA，可能会影响抑癌基因或原癌基因的表达，进而有可能触发细胞的癌变和恶变（参考文献 22–24）。
因此，我们设计了特定的实验，旨在探究 CRISPR-Cas 对潜伏感染 T 细胞系中 HIV 质粒的攻击是否可能引发涉及质粒 DNA 附近染色体序列的大范围非预期删除。
在连续 CRISPR-Cas 活动下大范围删除的检测
我们先前的研究已经证明，在 HIV 感染细胞中持续表达 Cas9 和单一抗病毒 gRNA 可以在质粒 DNA 的目标位点产生小的插入和删除及核苷酸替换（参考文献 6, 10, 16, 20；图 1A）。
为了研究这种治疗方法是否也会导致更大的删除，我们在潜伏感染的 Jurkat 衍生细胞系 J-Lat 8.4 和 J-Lat 9.2 中，使用 Cas9 和一个能够引导 Cas9 至 Tat 和 Rev 编码区重叠部分的 gRNA（gTatRev；图 1B）来靶向 HIV 质粒。
在 J-Lat 8.4 细胞的第 1 号染色体和 J-Lat 9.2 细胞的第 19 号染色体上，各存在一个 Env 和 Nef 禁用的 HIV-1 变体 HIV-R7/E-/GFP 的单一质粒 DNA 复制（参考文献 25）。细胞被转导了含有 Cas9 和 gTatRev 的慢病毒载体。转导两周后，我们收集了整个细胞培养中的细胞内 DNA，并进行了 PCR 分析。
为了识别 gTatRev 目标位点上游的大范围删除，我们使用了一组结合于整合的质粒 DNA 上游染色体 DNA 的正向引物（U0–U4, 图 1B）和一组结合于 gTatRev 目标位点下游 HIV DNA 的反向引物（Ra 和 Rb）。
这些引物组合之间的原始距离从大约 6 kb 到 10 kb 不等。然而，由于采用了较短的 30 秒 PCR 延长时间，这样长的 DNA 片段不会被有效地扩增，只有在 gTatRev 目标位点上游有大范围删除的 DNA 片段才能被检测到。
同理，为了发现下游的大范围删除，我们使用了一组结合于整合位点下游染色体 DNA 的反向引物（D0–D4）和一组结合于 gTatRev 位点上游 HIV DNA 的正向引物（Fa 和 Fb）。
对于这些引物组合，正反引物之间的原始距离从大约 4 kb 到 8 kb 不等。这样，只有在 Cas9 切割位点下游有大范围删除的质粒片段才会被有效扩增。之后，我们通过琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行了分析，并进行了克隆和测序。
在对经 Cas9/gTatRev 处理以及未经处理（对照组）的 J-Lat 9.2 细胞中提取的细胞 DNA 进行不同引物组合分析时，我们在处理组细胞中检测到了从几百到几千碱基对不等的 PCR 产物，而在对照组细胞中并未检测到这些产物（图 1C）。
对这些 PCR 产物进行克隆和测序后发现，它们大多数是被截断的 DNA 片段，这些片段在 gTatRev 目标位点的上游或下游有相对较大的 DNA 片段被删除（图 2A）。检测到的上游删除大小变化在 5,890 bp 到 7,899 bp 之间，且都在 Cas9/gTatRev 切割位点或其附近结束，这表明 Cas9 在预定目标处的切割触发了随后的删除。
同样地，下游删除的大小从 4,164 bp 到 6,527 bp 不等，都从预定的 Cas9/gTatRev 目标位点或其附近开始。在四个上游删除中有一个，以及四个下游删除中有三个不仅删除了质粒序列，还删除了邻近的染色体序列。
值得指出的是，并不是每一组引物都能成功检测到包含删除的 DNA 片段，有些 PCR 产物仅对应染色体序列。例如，U2/Ra 组合没有检测到 U3/Ra 组合所检测到的含删除片段，尽管 U2 结合位点并未被删除，但它产生了约 400 bp 的染色体 DNA 片段。
这种现象可能是由于每个引物的特定特性（如结合亲和力和在染色体 DNA 中的替代位置结合能力）和 CRISPR-Cas 处理可能产生的各种突变（大范围删除、小插入和删除以及核苷酸替换）的结果。
图。1 CRISPR-Cas 针对 HIV 质粒的攻击引发的大范围删除的检测。(A) CRISPR-Cas 对 HIV 质粒 DNA 的切割可能不只导致切割位点出现突变（插入、删除和核苷酸替换；这些突变以红色菱形表示），也可能导致意外的大范围删除，这可能涉及到相邻的染色体序列。(B) 通过 PCR 分析检测上游和下游的大范围删除，使用了多个位点的引物，这些引物结合在染色体 DNA（U0–U4，结合于 HIV 整合位点上游约 0 kb 至 4 kb 的正向引物；D1–D4，结合于 HIV 整合位点下游约 0 kb 至 4 kb 的反向引物）和质粒 DNA（Ra 和 Rb，反向引物 a 和 b；Fa 和 Fb，正向引物 a 和 b）上。(C) 对未经处理和经 Cas9 + gTatRev 处理的 J-Lat 9.2 细胞中整合的 HIV DNA 进行了 PCR 分析。使用不同引物组合得到的 PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳进行了分析。这里展示了一些示例凝胶图像（- 表示未处理样本；+ 表示经过 Cas9/gTatRev 处理的样本；左侧是 DNA 分子量标记）。在 Cas 处理之后特别检测到的 PCR 产物从凝胶中提取出来，并进行了测序。通过测序分析确认的大范围删除的 PCR 产物，用它们所使用的引物组合进行了标记。
在短暂 CRISPR-Cas 活动中检测到的大范围删除
我们使用了相同的 PCR 策略来检测潜伏感染的 SupT1 T 细胞在短暂接受 Cas9 或 Cas12a 核酸内切酶治疗后产生的大型 CRISPR-Cas 引发的删除。
这些细胞是通过感染 SupT1 T 细胞与一种由多西环素（dox）诱导的 HIV-1 变体（HIV-rtTA-GFP）生成的，并选择出了一个克隆细胞系，其中整合的质粒在未添加 dox 时处于潜伏状态，在添加 dox 后转录活跃，导致高水平的病毒产生和复制（参考文献 19）。
我们最近证明，通过重复地将 Cas9 或 Cas12a 蛋白与针对 Gag 和 TatRev 位点的 gRNAs/crRNAs 结合转染到这些细胞中，可以灭活质粒基因组，从而阻止了 dox 诱导的病毒产生。先前的 DNA 分析显示，这种双 gRNA 治疗通常会在 Cas 切割位点产生 indels，但也观察到了两个目标位点之间的病毒 DNA 片段在较小程度上发生切除和倒置（参考文献 19）。
为了检测大型 Cas 引发的上游删除，我们首先进行了 Alu PCR 分析（参考文献 26），以确定这些细胞中质粒的整合位点，结果显示整合位点位于第 15 号染色体上 IQ 基序含有的 GTPase 激活蛋白 1 基因座（见图 S1）。
随后我们设计了 PCR 引物，这些引物结合在第 15 号染色体上不同位置的整合位点上游以及 gTatRev 和 crTatRev 目标位点下游的质粒 DNA。不同引物组合的反向和正向引物之间的距离从 6 kb 到 10 kb 不等，由于使用了短的 30 秒 PCR 延长时间，只有 Cas 切割位点上游有大范围删除的截断质粒片段才会被有效地通过 PCR 扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物，然后进行克隆和测序，以确定大范围删除。对不同引物组合处理的 Cas9 细胞的分析发现了一处 5,744 bp 的质粒 DNA 删除，这可能是由最初在 gTatRev 位点的 Cas9 切割引起的（见图 3A）。
此外，还检测到了由于同时在 gGag1 和 gTatRev 位点切割并随后连接 DNA 末端而产生的切除产物（Δ4602）。类似地，对 Cas12a 处理的细胞的分析（见图 3B）发现了几个大型质粒 DNA 删除（Δ5326, Δ4610, Δ5841），以及包括周围染色体序列的更大删除（Δ5975, Δ6188）。
这些数据表明，短暂的 CRISPR-Cas9 或 Cas12a 治疗也可能导致超出整合 HIV-rtTA-GFP 基因组的大型染色体删除。
图２ 在 J-Lat 细胞中通过持续的 Cas9 对 HIV 质粒 DNA 的攻击检测到的大范围删除。在 J-Lat 9.2（A）和 J-Lat 8.4（B）细胞中，通过 PCR 分析和对 PCR 产物的测序（如图 1 中所述）发现了大范围的删除。左侧的标签说明了用于检测 DNA 片段的引物组合（如图 1 中所述）。当使用同一引物组合检测到多个片段时，会在标签上增加一个编号。展示了删除的位置和大小（用 ∆ 表示）。整合位点的 5 bp 重复序列（在 J-Lat 9.2 中为 CTTAT，在 J-Lat 8.4 中为 GAAAG）以及 Cas9/gTatRev 的切割位点在图表顶部标明。
Cas 引发的大范围删除的起源
对于我们观察到的所有大范围删除，其中一个断点连接处都位于或靠近原始 HIV 目标位点（如图 2 和图 3 所示），这表明靶向的 Cas 切割引发了这些大范围删除。另一个断点连接处则位于更远的质粒 DNA 区域或邻近的染色体 DNA 中。
通过将连接的序列与原始序列（上游和下游断点连接位点；见表 1）进行比较，我们发现在 29 个连接序列中有 14 个出现了短小的插入和删除（indels）。这种 indels 是 Cas 切割后容易发生错误的 DNA 修复过程中的典型结果（参考文献 11, 14, 15, 27）。
产生这类大范围删除的一个可能情景是双重切割事件，即同时在 HIV 的预定目标位点和邻近染色体 DNA 中的一个非目标位点发生切割，然后切除这两个位点之间的片段。我们利用 Cas-OFFinder 算法（参考文献 28）分析了质粒和周围染色体 DNA，以识别那些与 gRNA/crRNA 序列互补性不完全的潜在非目标位点（参考文献 29, 30）。
在允许 DNA 与 gRNA/crRNA 之间存在最多 6 nt 的不匹配，并且目标 DNA 序列中最多有 2 nt 的插入或删除的情况下，这项分析识别出了几个潜在的非目标位点（见图 4）。然而，这些位点都不位于或靠近我们观察到的断点连接处（见图 2 和图 3），这表明这些大范围删除并非由非目标 Cas 切割引起。
图３ 在对 SupT1-HIV-rtTA 细胞进行短暂治疗时，通过 Cas9 + gGag1 + gTatRev（A）或 Cas12a + crGag1 + crTatRev（B）对 HIV 质粒 DNA 的攻击，检测到了大范围的删除。这些大范围的删除是通过 PCR 分析和对 PCR 产物的测序发现的。这些大范围的删除被进行了标记，并且它们的位置和大小如图 2 所描述的那样指出。整合位点处的 5 bp 重复序列（GAAAG）以及 gRNA/crRNA 的目标位点都在图表的顶部标出。
另一种可能性是，Cas 在预定目标位点切割后，微同源介导的末端连接（MMEJ）DNA 修复机制可能导致了这些大范围删除的发生（参考文献 31-35）。因此，我们利用 mhScanR 应用程序来检查断点连接处是否存在微同源。
这项分析在 J-Lat 9.2 细胞的八个大范围删除中的七个（占 87.5%）以及 J-Lat 8.4 细胞的十四个大范围删除中的十一个（占 78.6%）的连接处发现了大小在 1 nt 到 5 nt 之间的短微同源（见表 1；图 5A），这表明 MMEJ DNA 修复参与了这些删除的形成。
值得注意的是，这项分析并未在潜伏感染的 SupT1 T 细胞经历短暂的 Cas9 和 Cas12a 处理后检测到的大范围删除的连接处发现任何微同源。
近期，Xin 等人（参考文献 36）研究了短暂用不同 Cas 核酸内切酶处理人胚胎肾 293T（HEK-293T）细胞时大范围删除的形成，包括我们研究中使用的 Cas9（SpCas9）和 Cas12a（AsCas12a）变体。他们发现在所有靶向的细胞基因中都检测到了大范围的删除，而不同 Cas 系统之间的频率差异很小，SpCas9 的频率为 1.9%，AsCas12a 的频率为总编辑事件的 1.4%。
Xin 等人还指出了每次编辑事件中断点连接处的微同源情况（参考文献 36）。我们利用这些数据（NCBI 基因表达组数据库；访问代码 GSE213149）计算了每种 Cas 及其靶标组合的微同源频率（见图 5B）。
这项分析揭示了由不同 Cas 变体引起的大范围删除具有类似的高微同源频率（79.2% 到 87.7%）。这一结果表明，在所有测试的 Cas 变体中，微同源介导的末端连接（MMEJ）DNA 修复途径可能参与了短暂处理的 293T 细胞中大范围删除的生成。
细胞系及培养
含有整合 HIV-R7/E-/GFP 基因组的 J-Lat 8.4 细胞和 J-Lat 9.2 细胞由 Eric Verdin 博士通过国家卫生研究院（NIH）的 HIV 试剂计划、艾滋病病毒学部、国家过敏和传染病研究所提供（参考文献 52）。
J-Lat 细胞在高级 RPMI-1640 培养基（Gibco，Life Technologies，荷兰 Bleiswijk）中培养，该培养基添加了 1% 胎牛血清、15 U/mL 青霉素、15 U/mL 链霉素混合物和 1% L-谷氨酰胺。之前已描述过含有整合的 dox 可控 HIV 变体（HIV-rtTA-GFP）的 SupT1-HIV-rtTA T 细胞的生产和培养（参考文献 19）。
人胚胎肾 293T 细胞则在杜尔贝克改良鹰培养基（DMEM；Gibco，Life Technologies，荷兰 Bleiswijk）中培养，这种培养基添加了 10% 小牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 mg/mL），正如之前所描述（参考文献 53）。
慢病毒载体转导用于持续的 CRISPR-Cas 编辑
慢病毒载体 LentiCas9-Blast（Addgene；52962）含有人类优化的链球菌 pyogenes Cas9 表达元件，而 LentiGuide-Puro（Addgene；52963）含有 gRNA 表达元件，这两者均由 Feng Zhang（参考文献 54）赠送。我们之前已描述过构建表达 gTatRev 的 LentiGuide-Puro 载体（参考文献 10）。
LentiCas9-Blast 和 LentiGuide-Puro-gTatRev 病毒载体颗粒的生产方法如前所述（参考文献 20, 55）。简而言之，293T 细胞在标准 DMEM 培养基中播种，然后使用 Lipofectamine 2000 与慢病毒载体质粒及包装质粒 pSYNGP、pRSV-rev 和 pVSV-g 进行转染。
转染 6 小时后，将培养基更换为添加青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 mg/mL）的 Opti-MEM（Gibco），细胞在 37°C 和 5% CO2 条件下培养 48 小时。含有慢病毒颗粒的上清液经 250 × g 短暂离心 5 分钟以去除细胞，然后过滤（0.45 µM）并使用 Vivaspin 20 超滤离心柱（100 kDa 分子量截断；Sartorius）浓缩。
样品分装后存放于 -80°C。为转导 J-Lat 8.4 和 J-Lat 9.2 细胞，首先将 2 × 10^5 细胞在 1 mL 培养基中用 LentiCas9-Blast 病毒颗粒（30 ng CA-p24）转导，并使用慢刀霉素（3 µg/mL）培养 14 天以筛选转导了 LentiCas9 的细胞。
然后，细胞用 LentiGuidePuro-gTatRev 载体颗粒（30 ng CA-p24）转导，并使用卡那霉素（0.5 µg/mL）培养以筛选双重转导的细胞。在第二次转导后 14 天，收集总细胞培养中的细胞内 DNA 用于分析整合的质粒 DNA 及其邻近的染色体序列。
CRISPR-Cas 试剂的核转染用于短暂编辑
SupT1-HIV-rtTA T 细胞在第 1、6 和 29 天分别进行了三次核转染，使用的是 Cas9 和 Cas12a 核糖核蛋白复合体，如之前所述（参考文献 19）。简单来说，为了制备 Cas9 RNP，通过混合等量的 200 µM crRNA（IDT）和 200 µM tracrRNA（IDT），在 95°C 加热 5 分钟后缓慢冷却，制备了 gRNA 双链。
然后将 100 皮摩尔的 gRNA 双链与 60 皮摩尔的 SpCas9 蛋白（TrueCut Cas9 Protein v2 NLS；Invitrogen A36499，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）结合。对于 Cas12a RNP 的制备，100 皮摩尔的 crRNA（IDT）与 60 皮摩尔的 AsCas12a 蛋白[Alt-R A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra nuclease；IDT，比利时卢文；10001273]结合。
使用 4D-Nucleofector X 单元和 SF 细胞系试剂盒 S（Lonza）及 CA-137 程序对细胞进行了 RNP 复合体的转染。在第三次核转染后 6 天，收集了总细胞 DNA 用于分析整合的质粒 DNA 及其邻近的染色体序列。
图４ 大范围删除的断点连接位点并不与可能的 CRISPR-Cas 非目标位点重合。对于每种潜伏感染的细胞和 Cas-gRNA/crRNA 组合，我们利用 Cas-OFFinder 算法（参考文献 28）分析了染色体和质粒序列，以识别可能的非目标位点。这个分析允许 DNA 和 gRNA/crRNA 之间存在最多 6 nt 的错配，以及 DNA 中最多 2 nt 的插入或删除。染色体 DNA 中潜在非目标位点的位置（仅展示了距离质粒整合位点最近的三个上游和三个下游位置；绿色标记）以及质粒 DNA 中的目标位点和潜在非目标位点的位置（黑色标记）都被标出（图线不按比例）。标记中还包括目标 DNA 中的错配数（从 0 到 6 不等）和插入或删除的 nt 数（从 0 到 2 不等），以括号形式表示（x/y；x 表示 nt 错配数；y 表示 nt 插入或删除数）。红色箭头表示目标切割位点。黑色箭头表示潜在的非目标切割位点。水平蓝线（标有星号）指出了大范围删除的断点连接位点所在的区域（如图 2 和图 3 所描述）。
Alu PCR 用于确定 HIV 整合位点
Alu PCR 分析（参考文献 26）被用于识别 SupT1-HIV-rtTA 细胞中 HIV-rtTA-GFP 的整合位点。使用 DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN）和 QIAshredder 微离心柱（QIAGEN）按之前描述的方法（参考文献 20）提取细胞 DNA。
在第一步 PCR 中，将100 ng 的总 DNA 与DreamTaq Green PCR Master Mix（K1081,Thermo Scientific）、50 pmol的引物Alu-R（5′-TGCTGGGATTACAGGCGTGAG-3′；结合 Alu 重复元素）和 50 pmol 的引物A0653（5′-TTGCTACAAGGGACTTTCCGCTGG-3′；结合病毒 LTR 中的 U3 区域）混合，总体积为 50 µL。
样品先在 95°C 变性 5 分钟，然后进行 35 个周期，每个周期包括 95°C 30 秒，58°C 30 秒和 72°C 30 秒。在 72°C 下额外延长 10 分钟后，1 µL 的 PCR 产物作为半嵌套 PCR 的模板，使用 DreamTaq Green PCR Master Mix、50 pmol 的引物 Alu-R 和 50 pmol 的引物 A1995（5′-TCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGC-3′；结合 LTR 中的 R 区域）。
在 25 个周期的 95°C 30 秒，58°C 30 秒和 72°C 30 秒以及最后的 72°C 10 分钟延长后，通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。从凝胶中分离出 PCR 产物，克隆到 pCRII-TOPO TA 克隆载体（Thermo Fisher Scientific，美国）中，并使用 BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Perkin Elmer Applied Biosystem）进行测序。使用 CodonCode Aligner 软件和 HIV-rtTA-GFP 参考序列识别 HIV 序列，并使用 NCBI 核苷酸 BLAST 工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）及“人类基因组加转录”数据库识别染色体序列。
为了确认第 15 号染色体上的 HIV 整合位点，使用结合 5´LTR 下游 HIV DNA 的引物（A1311，5′-CCTGTTCGGGCGCCACTGCTA-3′）或 3´LTR 上游（A1995）与结合 HIV DNA 上游（U0，5′-ACACTTTCTATCCCGAAGG-3′）或下游（D1，5′-CAGCCAAGCCATAATAGG-3′）的染色体 DNA 的引物进行 PCR 扩增，然后对 PCR 产物进行测序。
使用RepeatMasker 网站和开放数据库 Dfam 3.0（A.F.A. Smit、R. Hubley 和 P. Green，未发表数据。版本：open-4.0.9）识别 Alu 重复序列。
PCR 和测序分析用于检测大范围删除
使用 DNeasy Blood and Tissue Kit（QIAGEN）和 QIAshredder 微离心柱（QIAGEN）从对照组和接受 Cas 处理的细胞中提取总细胞 DNA。通过巢式 PCR 检测大范围删除。
使用 OligoAnalyzer 工具（IDT）、HIV-R7/E-/GFP 序列（参考文献 56）、HIV-rtTA-GFP 序列（参考文献 19, 57, 58）以及参考人类基因组序列（GRCh38.p14，RefSeq 组装访问号 GCF_000001405.40）设计引物（见表 S1）。在第一步 PCR 中，将 100 ng DNA 与 1 × DreamTaq Green PCR Master Mix、50 pmol 正向引物 1 和 50 pmol 反向引物 1（见表 S1）混合，总体积为 50 µL。
在 95°C 加热 5 分钟后，进行 35 个 PCR 循环，每个循环包括 95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒，最后在 72°C 延长 7 分钟，1 µL 的 PCR 混合物用作第二步 PCR 的模板，其中包含 1 × DreamTaq Green PCR Master Mix、50 pmol 正向引物 2 和 50 pmol 反向引物 2。
在 25 个循环的 95°C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒和最后的 72°C 7 分钟延长后，通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。仅在接受 Cas 处理的细胞中观察到的 PCR 产物被克隆到 pCRII-TOPO TA 克隆载体中并进行测序。使用 CodonCode Aligner（版本 10.0.2）将序列与参考序列进行对齐。利用 NCBI BLAST 工具来识别染色体序列。
非目标位点预测和微同源分析
使用Cas-OFFinder分析了参考人类基因组（GRCh38/hg38），以识别 Cas9 和 Cas12a 切割的潜在非目标位点。对于 SpCas9，该算法搜索了后跟 5′-NGG-3′ 原间隔相邻基序（PAM）序列的 20 个碱基对的 gRNA 目标序列。
对于 Cas12a，算法搜索了邻近 5′-TTTV-3′ PAM 序列的 23 个碱基对的 gRNA 目标序列。算法允许最多六个碱基对的错配以及最多两个核苷酸的插入（DNA 凸起）或删除（RNA 凸起）。参考 HIV-1 序列（NC_001802.1）也使用 Cas-OFFinder 进行了类似的分析，随后与 HIV-R7/E-/GFP 和 HIV-rtTA-GFP 序列进行了对齐。
R 包 mhscanR被用于识别由 Cas9 和 Cas12a 引起的大范围删除的断点连接处的微同源。
在先前的几项研究中，研究人员使用 CRISPR-Cas9 或 Cas12a 系统攻击 HIV 质粒 DNA，发现 Cas 切割通常会在目标位点引起小范围的插入和删除以及核苷酸替换。当质粒同时在两个或更多位置遭受攻击时，还观察到目标位点之间的 DNA 片段发生切除或倒置（参考文献 11, 16, 18）。
在这里，我们使用了基于 PCR 的测序策略，证明了 CRISPR-Cas9 和 Cas12a 治疗也可能导致更大范围的删除，这些删除可能包括周围的染色体 DNA 序列。由于观察到的删除始于预定的 gRNA 目标位点，因此很可能是由靶向的 Cas 切割活动引发的。我们还展示了大范围删除的断点连接处经常出现微同源，这表明微同源介导的末端连接（MMEJ）DNA 修复机制参与了这些大范围删除的形成。
在早期的 HIV 研究中并未检测到这种大范围的删除，这主要是因为大多数研究采用了基于 PCR 的方法，其中的引物结合在距离预定 DNA 切割位点相对较近的位置，而大范围的删除通常会导致至少一个引物结合位点被移除。通过使用结合在质粒 DNA 周围染色体 DNA 上的更远端引物，我们能够检测到由 Cas 引起的高达 9.2 kb 的大范围删除。
尽管更大的删除很可能发生，但在我们的分析中它们可能会被漏检，因为其中一个引物结合位点可能会丢失。因此，在使用基于 PCR 的策略分析 Cas 编辑产品时需要格外小心。补充使用 RNA 分析来评估是否形成了异常转录本可能是必要的，这可以帮助确认 CRISPR-Cas 治疗的潜在有害效果。
我们对 HIV 编辑的发现与使用 CRISPR-Cas9 系统进行其他基因组编辑研究的结果相符合（参考文献 37-39）。在这些研究中，也发现了切割位点上游或下游的大范围删除。例如，Wen 等人报道，在 Cas9/gRNA 处理人类 T 细胞时，观察到的大多数大范围删除大小在 100 到 1,000 bp 之间，但有些删除可能扩展到数千碱基对（参考文献 39）。
Cas 切割甚至可能导致染色体截断（参考文献 40）和重排（参考文献 41），并触发基因组不稳定（参考文献 42）。我们在 J-Lat 细胞中 Cas9 引起的大多数大范围删除的断点连接处观察到了微同源（占 82%），这与其他 CRISPR-Cas 研究中的高频微同源标记相一致（参考文献 31, 35, 36）。
最近，Xin 等人（参考文献 36）在针对不同 Cas 核酸酶的细胞基因的 HEK-293T 细胞中报告了大范围删除的产生。他们的补充数据分析显示了由不同 Cas 变体引起的大范围删除的断点连接处也有类似的高频小微同源，SpCas9 和 AsCas12a 引起的删除频率分别为 79% 和 85%（见图 5B）。
总的来说，这些结果表明大范围删除通常是由 Cas 切割后的微同源介导的末端连接（MMEJ）DNA 修复过程引起的。然而，令人惊讶的是，我们在短暂经 Cas9 和 Cas12a 处理的感染了的 SupT1 T 细胞中检测到的大范围删除的断点连接处并未发现任何微同源。我们的有限数据可能暗示，细胞类型可能影响细胞 DNA 修复过程和大范围删除的形成，但进一步分析是必要的以便更好地理解这一观察结果。
我们在这里证明了 CRISPR-Cas 攻击整合在 HIV DNA 上可能会导致包括邻近染色体 DNA 序列的大型非预期删除。这类大范围的删除可能会导致抑癌基因的丢失或原癌基因的激活，从而可能引发癌变（参考文献 22-24）。
这种有害事件的发生频率可能较低，尤其是当靶向 HIV 基因组的中心位置时。然而，当靶向靠近质粒 5´ 或 3´ 端的位置，如长末端重复（LTR）区域时，这种频率可能会增加。LTR 是一个受欢迎的靶点，因为它出现在质粒 DNA 的 5´ 和 3´ 端，双重切割可能允许用单个引导 RNA 切除几乎整个病毒基因组（参考文献 43-45）。
此外，HIV 的随机整合在任一染色体上，增加了击中附近原癌基因或抑癌基因的可能性（参考文献 22-24, 46）。可以考虑采用几种策略来减少 CRISPR-Cas 治疗期间大范围删除的频率，包括使用替代的 Cas 核酸酶，如 CasMINI（一种改造的 Un1Cas12f1）和 AsCas12f1（参考文献 36），或使用抑制 MMEJ 途径的药物（参考文献 47-49）。
然而，这些策略到目前为止效果有限，无法防止大范围删除的形成（参考文献 36, 47-49）。最近开始的使用 CRISPR-Cas9 在感染者中灭活 HIV 的临床试验（参考文献 50, 51）中，密切监控非预期的大范围删除和治疗者细胞的癌变非常重要，因为这可能构成严重的安全风险。
注释：
ASM - American Society for Microbiology - 美国微生物学会
PCR - Polymerase Chain Reaction - 聚合酶链反应
RNP - Ribonucleoprotein - 核糖核蛋白复合体
NCBI BLAST - National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool - 美国国立生物技术信息中心基本局部比对搜索工具
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium - 杜尔贝克改良鹰培养基
LTR - Long Terminal Repeat - 长末端重复序列
PAM - Protospacer Adjacent Motif - 原间隔相邻基序
GRCh38 - Genome Reference Consortium Human Build 38 - 基因组参考协会人类构建38
信息来源：ASM Journals Journal of Virology Vol. 97, No. 12 CRISPR-Cas attack of HIV-1 proviral DNA can cause unintended deletion of surrounding cellular DNA
信息来源：【互联网】
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