研究发现：HIV低病毒血症的真实原因并非耐药或依从性不佳
发布日期：2023-12-24
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本文原名为“非抑制性HIV-1病毒血症的病毒和宿主介质”，作者为Abbas Mohammadi,Behzad Etemad等人。文章2023年11月13日发表在《Nature Medicine》。《Nature Medicine》是一份国际知名的同行评审科学期刊，专注于医学和生物医学领域的最新研究成果。它是《自然》出版集团旗下的一份杂志，以发表高质量的原创研究、评论和分析文章而闻名。
这篇文章主要讨论了即使在接受抗逆转录病毒治疗（ART）的情况下，仍有一部分HIV感染者体内持续存在低水平病毒载量（非抑制性病毒血症，NSV）的现象。研究发现，这种持续的病毒血症不是由耐药性或治疗依从性不佳引起的，而是由特定的宿主和病毒因素共同作用的结果。
这些因素包括在某些染色体区域内整合的大量HIV-1原病毒克隆，这些克隆可能含有免疫逃逸突变或5'前导区域的缺陷。此外，研究还发现，NSV患者体内的免疫反应相对较弱，这可能与HIV特异性CD8+T细胞的低活性和原病毒整合位点的表观遗传特性有关。这些发现有助于更深入地理解HIV持久性的机制，并可能为开发新的治疗策略提供线索。
非抑制性HIV-1病毒血症（NSV）被定义为在接受抗逆转录病毒治疗（ART）的情况下仍持续的低水平病毒载量，且没有因不遵守治疗处方或显著耐药性而导致的。揭示NSV背后的机制有助于加深我们对HIV-1持续存在的理解。
我们分析了8名接受ART治疗的患者（其中88%为男性）的血浆病毒序列，发现这些病毒由大量克隆组成，在长期样本中没有发现病毒随时间进化的证据。我们将与血浆HIV-1RNA序列匹配的原病毒定义为“生产者原病毒”，不匹配的则为“非生产者原病毒”。
不可抑制的病毒血症来自于扩展的生产者原病毒克隆体，这些克隆体明显大于接受ART治疗的个体中完整基因组的原病毒储藏库。生产者原病毒的整合位点在激活的H3K36me3表观遗传标记附近富集。
NSV患者的CD4+T细胞表现出抗凋亡基因的上调和促凋亡及I/II型干扰素相关途径的下调。此外，与未经治疗的病毒载量相似的病毒血症可控制者相比，NSV患者的HIV特异性CD8+T细胞反应显著减弱。我们发现了可能是NSV的关键宿主和病毒介质，这些介质可能是打破HIV-1持久性的潜在目标。
对大多数人类免疫缺陷病毒（PWH）感染者来说，抗逆转录病毒治疗（ART）能将HIV-1RNA降至低于商业检测水平。但是，有一部分PWH在接受ART治疗期间仍然存在持续的低水平病毒载量，这不仅给医生带来了临床上的难题，也可能对患者造成极大的心理负担和压力。
通常认为，持续的低水平病毒血症是由于ART依从性不佳和/或HIV-1耐药性的积累所致。先前的研究显示，在低但可检测的范围内持续存在的病毒血症可能导致ART耐药突变的累积，从而增加病毒学失败的风险。
然而，一些有趣的证据表明，持续的低水平病毒载量可以长期维持，而不会导致高水平的病毒学失败或新的耐药突变。这些没有显示出ART不遵守处方或显著耐药性的持续低水平病毒血症患者被定义为存在不可抑制的HIV-1病毒血症（NSV）。
HIV感染细胞的克隆扩展被视为HIV-1持续存在的一个关键因素，最近的研究也指出这在不可抑制病毒血症（NSV）中同样扮演着重要角色。Halvas及其团队研究了一组NSV患者，他们发现大部分血浆变异体由相同的序列簇组成，这些序列簇没有显示病毒进化的迹象，这表明血浆病毒源于一个转录活跃的病毒储藏库，而非新的感染轮次。
虽然NSV是由大量克隆扩展的HIV感染细胞驱动的，但导致NSV形成和维持的机制，以及产生NSV的原病毒储藏库，还未得到充分研究。在本文中，我们描述了八名NSV患者的一组研究，并进行了深入的ART药物浓度测试，同时对病毒和宿主细胞的遗传学/基因组学和免疫特性进行了分析。
我们鉴定了区分促进NSV的原病毒和无贡献原病毒的宿主整合位点的特征。转录组学和免疫表型研究进一步突出了NSV患者中可能存在的宽容宿主细胞和细胞免疫环境。这些成果为迄今对NSV的病毒、细胞和免疫介质提供了最全面的评估。
我们招募了八名持续经历不可抑制病毒血症（NSV）的参与者，其中88%为男性，平均年龄为60岁，平均接受抗逆转录病毒治疗（ART）的时间为10年。所有参与者在NSV前的平均病毒学抑制时间为4年，NSV持续时间为2年。在NSV期间，平均病毒载量为143拷贝/毫升，平均CD4计数为798细胞/微升（详见表1及补充表1）。
参与者的个人特征、ART治疗方案和NSV期间血浆病毒的基因型敏感性评分（GSS）见于补充表1。所有参与者在NSV期间至少使用了两种有效的抗逆转录病毒药物。接受ART抑制和病毒载量控制者（VCs）的历史对比参与者特征见于补充表2至4。
我们通过测量血浆中抗逆转录病毒药物（及其代谢产物）的浓度或进行干血斑（DBS）测试来评估ART的依从性。LV1和LV2的血浆中多替拉韦和达芦那韦的浓度符合持续使用ART的情况（详见补充表5）。
LV3和LV5-9进行了替诺福韦（TFV-DP，用以衡量累积的替诺福韦/替诺福韦艾拉酚胺累积依从性的指标）和恩曲他滨（FTC-TP，用以衡量近7天内的恩曲他滨服用情况）的DBS测试。FTC-TP的中位（范围）水平为每次冲击5（4.4-6.7）皮摩，TFV-DP水平为每次冲击3,702（2,771-6,684）飞摩。
这些浓度与接受ART治疗且病毒被抑制的个体的预期水平相符，包括抑制病毒的最高概率和未来病毒血症最低风险，这表明我们的NSV参与者在短期和累积ART依从性方面都表现出高水平（详见补充图1和补充表5）。
HIV-1整合到宿主基因组的偏好特征与活跃染色质的多种特性相关，包括转录活性、组蛋白表观遗传标记以及核散斑的接近度。随着时间的推移，储藏库的情况会因响应ART和宿主免疫反应而发生变化，最终达到一种由细胞丢失和克隆扩展标记的准稳态。这项研究的主要目标之一是评估对NSV产生贡献的宿主原病毒的各种特征。我们对接近全长的原病毒和血浆HIV-1pol-envRNA进行了纵向的单基因组测序。
为八名NSV患者生成了共计1,987个单基因组原病毒序列和222个单基因组血浆序列。其中四名有可用样本的参与者（LV1、LV7、LV8和LV9）进行了纵向血浆HIV-1序列的采集，平均在4.5个不同时间点进行，平均间隔9.7个月（参见图1a和扩展数据图1）。虽然在NSV期间对一些参与者的ART方案进行了调整，但他们并未实现病毒学上的抑制（参见扩展数据图1）。
系统发生分析证实，每位参与者的序列分别归属于不同的群集（见补充图2）。我们随后寻找了一致于新细胞活跃感染的HIV-1序列随时间变化的证据。对这八名参与者的原病毒和血浆序列进行的邻接连接树分析显示，血浆序列主要由一到两个克隆体主导，没有显示出病毒进化的迹象，这与血浆病毒源自转录活跃的HIV-1感染细胞群的情况一致（见图1b和2a）。
在初始分析中，如果原病毒序列没有明显缺陷或与血浆序列相关联，则被视为完整。研究开始时，两个最大的血浆HIV-1克隆体占所有血浆序列的中位数为71%（第一四分位至第三四分位：27–83%），并与所有完整原病毒序列的中位数为26%（第一四分位至第三四分位：14–61%）相联系（见扩展数据图2a）。
总体而言，完整原病毒占原病毒储藏库的中位数为4.5%（第一四分位至第三四分位：3.8–15%），其中两名参与者（LV2和LV9）展现了较高的变异性。LV2和LV9的原病毒库由几个大型完整序列克隆体主导，分别占其总外周血单个核细胞（PBMC）原病毒储藏库的76%和34%（见扩展数据图2b,c）
图1|患有不可抑制病毒血症（LV1）的参与者示例。
a，病毒学抑制时的病毒载量和CD4+T细胞计数。向下的蓝色和橙色箭头分别表示耐药性和血浆药物水平测试的时间。病毒遗传分析的采样时间用黑色箭头表示。临床测试的抗逆转录病毒耐药性突变和单基因组测序的最大血浆克隆如表插页所示。“(C)”是指“(C)”。表示临床耐药性测试结果。b，原病毒和血浆pol-env序列的邻接树分别为蓝色和红色。生产者被定义为与血浆HIV-1RNA序列完全匹配的原病毒。非生产者是与任何血浆HIV-1RNA序列都不匹配的原病毒。shape表示采样时间点，对应a中的黑色箭头。RPV，利匹韦林；TDF，富马酸替诺福韦二吡呋酯；FTC，恩曲他滨；ATV/r，阿扎那韦/利托那韦；TAF，替诺福韦艾拉酚胺；DTG，多替拉韦；DRV/r，达芦那韦/利托那韦；NRTI，核苷逆转录酶抑制剂；NNRTI，非核苷逆转录酶抑制剂；IN，整合酶；PI，蛋白酶抑制剂。
我们将与血浆序列匹配的原病毒归类为“生产者”，不匹配的则为“非生产者”。在储藏库中，生产者原病毒的数量范围广泛。例如，LV2的外周血单个核细胞（PBMC）原病毒储藏库主要由一个大的生产者克隆体构成，占完整原病毒的98%，与大型血浆NSV克隆体相匹配（见图2a）。
相反，LV3的生产者储藏库规模最小，仅占总完整序列的3.5%。这些结果说明，尽管这些个体表现出共同的NSV表型，但他们的原病毒景观可能存在高度异质性（见扩展数据图2b,c）。
接着，我们将NSV参与者与10名接受ART治疗的对照组成员的完整和有缺陷的原病毒储藏库大小进行了比较（详见补充表2）。NSV参与者的总原病毒储藏库规模更大，且完整的外周血单个核细胞（PBMC）原病毒储藏库显著更大（NSV与ART抑制：中位数总原病毒基因组为每百万细胞34个对18个，P=0.08；中位数完整原病毒基因组为每百万细胞4.3个对0.1个，P=0.001）。
具体来说，NSV参与者的生产者原病毒储藏库的大小显著大于这些参与者的非生产者完整原病毒储藏库或ART抑制参与者的完整原病毒储藏库（见图2b）。此外，NSV参与者拥有较少的带有大片段缺失的原病毒（中位数为每百万细胞2.6个对10.7个，P=0.006）。这些结果表明，扩大的生产者储藏库规模可能是导致NSV的一个重要因素。
图2|非抑制性病毒血症队列的测序概述。
a,邻接连接树展示了不同时间点的完整原病毒和血浆序列。标记了生产者原病毒的宿主整合位点。b,比较了NSV参与者中生产者原病毒与非生产者原病毒的储藏库规模（每百万细胞的原病毒序列数量）与接受ART治疗的个体中完整原病毒储藏库的规模。小提琴图中标出了中位数和四分位间距。两侧Wilcoxon配对符号秩测试和Mann–WhitneyU测试用于比较。
HIV-1原病毒整合位点的位置和染色质环境可以影响原病毒转录活性的程度。我们据此评估了特定的整合位点特征是否区分了生产者、非生产者和有缺陷的原病毒。
通过使用匹配整合位点和原病毒测序（MIP-seq）技术，我们在所有NSV参与者中为11个生产者、21个完整的非生产者和44个有缺陷的原病毒确定了宿主染色体的整合位点（我们未能为LV3生产者克隆确定整合位点）。整合位点被发现在所有常染色体和性染色体上，21号染色体除外（见图3a）。
与非生产者和有缺陷的原病毒相比，生产者原病毒的整合位点在19号染色体上更为集中。27%（3/11）的生产者原病毒位于19号染色体，而在21个非生产者和44个有缺陷的原病毒中则未发现（生产者与非生产者对比P=0.03，生产者与有缺陷的对比P=0.006，见图3b）。
我们还发现生产者原病毒在两个表观遗传标记附近显著富集。使用原发性CD4+T细胞中的染色质免疫沉淀后测序（ChIP–seq）数据，该数据发表在ROADMAP数据库上，我们检测到与非生产者或有缺陷的整合位点相比，生产者整合位点附近的H3K36me3和H3K9me3组蛋白标记的ChIP–seq峰值数量显著增多（见图3c）。
我们计算了由生产者原病毒贡献的血浆病毒血症，我们称之为血浆克隆病毒血症。我们发现生产者原病毒整合位点附近的H3K36me3ChIP–seq读数与血浆克隆病毒血症之间存在显著正相关（Spearmanr=0.83,P=0.001，见图3d）。
H3K36me3的近邻性与原病毒基因表达有关，这表明生产者原病毒在染色体的转录活跃区域附近富集，并且可能利用细胞的转录机制来进行原病毒表达和病毒颗粒的生产。此外，两个其他激活组蛋白标记（H3K27ac和H3K4me1）邻近区域的ChIP–seq峰值数量更高，这与含有整合原病毒的宿主基因的更高表达水平相关（见扩展数据图3a），尽管这些组蛋白标记并未在生产者原病毒附近富集。
有些染色体特征与生产者细胞原病毒的表型无关联。无论宿主基因和原病毒的取向如何，生产者、非生产者和有缺陷的原病毒与转录起始位点（TSSs）的距离在统计上没有显著差异（见扩展数据图3b-d）。
我们也没有发现生产者、非生产者和有缺陷的原病毒类别在与异染色质着丝粒的距离或整合到转录活跃斑点相关域的比例方面存在显著差异（见扩展数据图3e,f）。
最后，通过对NSV参与者CD4+T细胞的RNA-seq分析，我们未发现生产者、非生产者和有缺陷的原病毒在宿主基因转录水平上存在显著差异，无论原病毒与宿主基因的整合方向如何（见扩展数据图3g,h）。
图3|HIV-1原病毒的整合位点和染色质特征。
a，Circos图显示人类染色体上每个整合位点的位置。b，核型分析热图，显示不同类别原病毒在每个人类染色体中的整合位点百分比。使用费舍尔精确检验。c，原病毒整合位点两侧10kb区域中关键组蛋白标记的峰数。中心线代表中位数。我们使用Tukey箱线图，其中箱代表中值和第一至第三四分位数。采用双边Kruskal–Wallis检验评估三组之间是否存在显着差异，如果存在显着差异，则采用双边Mann–WhitneyU检验用于比较组间差异。d，生产者原病毒整合位点附近H3K36me3组蛋白标记的富集与血浆克隆病毒载量（病毒载量乘以与生产者原病毒匹配的血浆序列分数）之间的相关性）。宿主基因整合位点被标记。采用双边Spearman相关性检验。VL，病毒载量。
细胞存活信号与HIV-1持久性有关，特别是在潜伏感染的CD4+T细胞中。为了理解细胞信号与NSV之间的联系，我们比较了NSV组（N=8）与接受ART治疗的一组个体（N=5）的CD4+T细胞转录组特征，这组个体有可用的RNA测序（RNA-seq）数据。
与接受ART治疗的个体相比，NSV参与者的总CD4+T细胞中有265个上调基因和427个下调基因（调整后P值(Padj)<0.1，见图4a）。在这些差异表达基因中，基因集富集分析（GSEA）揭示了与HIV-1感染、HIV-1生命周期和转录相关途径在NSV组的富集（见图4b）。NSV组的CD4+T细胞在氧化磷酸化和与凋亡相关的信号上呈现出富集（见图4b顶部和扩展数据图4a）。
具体而言，NSV参与者的CD4+T细胞似乎通过下调促凋亡基因和上调与抗凋亡途径相关的基因，包括与蛋白酶体相关的基因（如PSMB1、PSMB2和PSMD14）、与泛素化相关的基因，以及像PIK3CA和PIK3R1这样的癌基因，为生存做好了准备（见图4c,d）。
转录组分析还揭示了NSV与接受ART治疗个体之间免疫反应的差异。NSV参与者的总CD4+T细胞中展示了与免疫抑制相关的基因上调，包括CTLA4和FOXP3（见图4a），这表明了与RUNX1相关途径的富集，该途径与通过FOXP3结合而减弱抗病毒和干扰素（IFN）信号相关。
实际上，IFN-α/β和IFN-γ信号在接受ART治疗的个体中更为富集（见图4b底部和扩展数据图4b,c）。IFN信号在HIV-1的发病机制中起着核心作用，通过诱导病毒限制因子，导致CD4+T细胞的耗竭，并调节系统性免疫激活。这些结果可能指向免疫介导控制高度活跃HIV-1储藏库的潜在缺陷是NSV的一个贡献因素。
我们进一步评估了NSV对炎症和免疫激活的影响。我们比较了NSV参与者和接受ART治疗的参与者血浆中12种可溶性炎症标志物的水平。NSV参与者显示出较低的IL-10和升高的IL-6水平，但与接受ART治疗的个体相比，C-反应蛋白、sCD14和sCD163的水平没有显著差异（见扩展数据图5）。
值得注意的是，NSV参与者较高的年龄可能导致他们与接受ART治疗的参与者相比IL-6水平更高。我们还比较了NSV参与者、接受ART治疗的参与者和一组能够在不使用ART的情况下实现对HIV-1复制免疫介导控制的历史性VCs的活化HLA-DR+CD38+CD4+和CD8+T细胞水平。
尽管与VCs的病毒血症相似（见扩展数据图6a），NSV参与者的CD8+T细胞激活水平显著低于VCs，与接受ART治疗的个体相当（见图5a）。在CD4表达细胞的强度和频率方面，各组之间没有差异（见扩展数据图6b,c）。
能识别与HLA-I类（HLA-A、HLA-B和HLA-C）复合体呈现的病毒肽的HIV特异性CD8+T细胞被认为是病毒控制的关键介质之一。在NSV、接受ART治疗和VC参与者中，效应HLA限制的HIV特异性T细胞活性和增殖性HIV特异性CD8+T细胞与整体CD8+T细胞激活程度相一致。与NSV和接受ART治疗的参与者相比，VCs通过IFN-γELISpot和T细胞增殖测定表现出显著更强的HIV特异性CD8+T细胞反应（见图5b,c）。
在VCs中，针对HIV-1Gag、Pol、Env和Nef肽的HIV特异性CD8+T细胞反应增强，其中对Gag的反应最为强烈（见扩展数据图7）。值得注意的是，NSV中相对较弱的HIV特异性CD8+T细胞反应与生产者原病毒中适应性（逃逸）突变的平均数量略有增加（与非生产者相比P=0.04），与有缺陷的原病毒相比逃逸负担显著增加，经过原病毒长度调整后（P=0.001，见图5d）。
对每个HIV-1基因的大小进行归一化后，nef显示出比其他HIV-1基因显著更多的适应性和可能适应性突变（见图5e和扩展数据图8）。在生产者和非生产者的HIV-1基因组中，适应性和可能适应性突变与CD8+T细胞IFN-γ释放高度相关，但与增殖无关（见图5f,g），这表明效应HIV特异性CD8+T细胞反应与相对降低的功能性（即增殖）之间的关系，以及原病毒克隆体内突变的随后出现。
特别是，生产者原病毒中nef的适应性和可能适应性突变的数量与NSV中CD8+T细胞IFN-γ释放强相关（r=0.94,P=0.02，见图5f,h）。生产者原病毒中pol的适应性和可能适应性突变也与总CD8+T细胞活性显著相关（r=0.84,P=0.04，见图5i），这可能代表在ART启动前积累的免疫驱动的病毒逃逸突变。
我们的测序结果表明，NSV主要由一个或两个随时间保持稳定的克隆群体组成，这与高水平的病毒产生主要由大量克隆扩展的HIV-1感染细胞群体驱动，而非在ART治疗下持续的病毒复制相符。
考虑到NSV不必由具有感染性的病毒组成，我们评估了生产者原病毒是否存在潜在的复制缺陷，包括在5′PSI包装元素中的缺失。在38%（3/8）的NSV参与者中，我们观察到生产者原病毒在HIV-1基因组5′端有缺失（见扩展数据图9，黑色框）。
这些缺失，分别在参与者LV4、LV7和LV8中包含22、15和41个核苷酸，都发生在SL1和SL2元素内，并在剪接供体位点的同一位置结束。为了确认这些5′缺陷存在于血浆HIV-1RNA序列中，对HIV-1的5′先导/gag区域进行了血浆HIV-1RNA测序。
为了评估这些原病毒是否具有感染性，使用了一个跨膜系统进行了病毒外增殖测定（VOA），该系统的底部室包含参与者的CD4+T细胞（LV4、LV7和LV8；LV2、LV5和LV9作为对照），上部室包含MOLT-4/CCR5细胞。对MOLT-4细胞中的HIV-1DNA进行了提取和MIP-seq分析。
在VOA中，没有分离出带有5′缺失的原病毒。从VOA中分离出了LV9的生产者原病毒（见图2a和扩展数据图10）。从VOA中分离出了LV2、LV5和LV8的非生产者原病毒（见图2a）。
在这项研究中，我们对八名参与者中的不可抑制病毒血症（NSV）进行了全面评估，并提供了关于与抗逆转录病毒治疗（ART）无关的因素在HIV-1抑制和持久性中的作用的见解。我们的结果表明，次优的ART依从性和耐药性似乎不是导致不可抑制病毒血症的主要因素。
在这些参与者中，我们的数据表明，NSV更可能是由病毒和宿主免疫因素的关键交集所驱动。具体来说，NSV表型的显著特点是存在大量克隆扩展的原病毒储藏库，这些储藏库常常含有免疫逃逸突变（和/或5′前导区域的缺陷），并整合在转录许可的染色体区域内，在为生存做好准备的CD4+T细胞中，以及在HIV特异性T细胞反应减弱的环境中（见补充图3）。
在Halvas等人进行的NSV的首批深入储藏库研究之一中，他们报告称NSV主要由相同的血浆病毒群体组成，这些病毒来自于HIV感染的CD4+T细胞克隆的扩展，他们将这些称为复制克隆体。
然而，大多数之前的研究对病毒RNA的较短片段进行了测序，这可能导致对血浆序列克隆性的高估。我们的血浆HIV-1RNA测序分析结合了一个超灵敏的RNA提取过程，用于6.7kb的pol-envRNA-seq（见扩展数据图10）。这些结果证实，在我们的队列中，NSV主要由一到两个大型血浆病毒克隆组成，占血浆病毒的>70%。
这些病毒克隆作为NSV的主要驱动因素在多个纵向时间点得到了证实，这些时间点未揭示血浆病毒序列的变化和进化的证据。对于所有NSV参与者，我们都能够识别出与大型血浆克隆完全匹配的原病毒序列。
我们发现，生产者原病毒储藏库的大小显著大于NSV参与者中非生产者原病毒的大小，或接受ART治疗的参与者中完整原病毒的大小，尽管生产者原病毒储藏库的大小分布广泛。
图4|CD4+的转录组分析来自患有NSV的参与者的T细胞。
a,火山图展示了NSV参与者与接受ART治疗的个体之间差异表达基因（DEGs）。红色和蓝色高亮显示了差异的统计显著性。使用DESeq2软件包中的Benjamini–Hochberg方法进行了多重比较调整。b,归一化富集得分（NES）反映了在NSV参与者与接受ART治疗的对照组之间差异表达基因中，一组基因的过度代表程度。条形图表示正相关（红色）和负相关（蓝色）的途径。使用Benjamini–Hochberg方法进行了多重比较调整。c,在NSV参与者中富集的与凋亡/细胞死亡相关的基因。d,比较NSV与接受ART治疗的对照组之间抗凋亡和促凋亡基因转录水平的差异。使用双侧Mann–WhitneyU检验进行比较。TPM表示每百万转录本。
这些生产者原病毒储藏库的大规模和它们在多年中维持NSV的能力凸显了这个储藏库的相对稳定性。这些结果，加上多年来NSV的持续存在，表明这些HIV感染细胞具有维持长期存活和/或增殖的内在能力。
先前的研究报告称，调节关键的促凋亡和抗凋亡途径的CD4+T细胞可以维持HIV感染细胞的存活，推动克隆扩展，并防御CTLs。与接受ART治疗的参与者相比，NSV参与者的CD4+T细胞在转录水平上表现出抗凋亡途径的上调和促凋亡途径的下调。
虽然转录分析并未仅针对生产者细胞，但这些结果表明NSV参与者的CD4+T细胞环境为存活做好了准备。淋巴克隆造血（L-CH）指的是与年龄相关的造血干细胞克隆的扩展，这是由体细胞中特定点突变或染色体变化的获得引发的。最近的研究揭示了L-CH在自身免疫性或免疫缺陷等条件中的存在，未来应研究L-CH在NSV中的作用。
使用MIP-seq测序，我们能够确定NSV参与者中11个生产者、21个完整非生产者和44个有缺陷的原病毒在宿主染色体上HIV-1整合位点的位置。已知HIV-1的整合倾向于活跃的染色质，并且与激活的表观遗传标记的邻近度可以调节原病毒基因的表达，从而影响所在原病毒和感染细胞的命运。
我们和其他研究者已经报告，经过长期的ART治疗，完整的原病毒更可能出现在非基因区域、与宿主基因方向相反，并且距离可接近的染色体区域更远，这突显了完整原病毒整合到深度潜伏区域的选择性。
在NSV参与者中，我们发现了19号染色体上整合的富集，这一染色体以基因密度丰富而著称。我们还证明了生产者原病毒位于某些表观遗传特征丰富的区域，包括较多的H3K36me3组蛋白峰，这与转录许可的染色体区域和提高的原病毒表达相关。
围绕生产者原病毒的较多H3K36me3峰与由该克隆组成的较高血浆病毒血症之间也存在强烈的相关性。这些结果表明，HIV-1原病毒在宿主基因组中的整合位置是其最终命运的决定因素，并与新兴的证据相符，这些证据表明进入和退出原病毒转录潜伏的过程受到表观遗传机制的影响，因此可能易受药物干预。
图5|HIV特异性CD8+T细胞反应和HLAI类逃避突变。
a,CD4+和CD8+T细胞中HLA-DR+CD38+的频率。b,在NSV、接受ART治疗和病毒控制者（VC）群体中，HIV特异性CD8+T细胞ELISPOT反应。SFU代表形成斑点单位。c,HIV特异性CD8+T细胞的增殖反应。小提琴图显示了中位数和四分位数范围。使用双侧Mann–WhitneyU检验。d,生产者、非生产者和有缺陷的原病毒序列中每个碱基的适应性和可能适应性HLA逃逸突变的平均数量。使用Wilcoxon配对符号秩检验。e,生产者原病毒中每个HIV-1基因的每对碱基平均突变数量（n=8）。使用双侧配对Wilcoxon符号秩检验，并使用Benjamini–Hochberg方法进行多重比较调整。箱线图中，中心线表示中位数，箱体边界表示上下四分位数，须线表示最小和最大值。f,生产者原病毒中不同HIV-1基因的适应性和可能适应性突变与CD8+T细胞增殖活性和完整原病毒百分比之间的Spearman相关性。g,三类原病毒和CD8+T细胞活性（ELISPOT）之间适应性和可能适应性突变的Spearman相关性。h,i,CD8+T细胞活性（ELISPOT）与生产者原病毒中nef（h）和pol（i）的适应性和可能适应性突变的平均数量（按基因大小归一化）之间的Spearman相关性。使用Spearman相关性检验。NS表示无显著性；*P < 0.05，**P < 0.01。
我们发现，不可抑制病毒血症的持续发生在相对缓和的炎症和免疫激活环境中，其特征包括IFN反应基因的下调、可溶性炎症标记物的普遍低水平，以及与接受ART治疗的个体相比，没有HIV特异性CD8+T细胞反应的显著增加。
IFN在宿主先天性抗病毒反应中发挥着关键作用，并有助于抑制HIV-1病毒血症。与接受ART治疗的参与者相比，NSV参与者通过总CD4转录组分析显著下调了多个参与IFN反应途径的基因的转录。这些包括IFN调节因子3和7（IRF3和IRF7）、OAS1和其他已知是刺激宿主抗病毒免疫反应关键环节的一部分的基因。尽管转录组分析仅在总CD4细胞上进行，但结果确实提供了一些与潜伏逆转和细胞存活相关的有趣信号。
例如，BIRC2是一种抑制凋亡的蛋白（IAP），它可以抑制HIV-1转录，而BIRC2的消耗可以导致HIV-1潜伏逆转。NSV参与者下调了TNFRSF14的表达，TNFRSF14是LIGHT/TNFSF14配体的受体，与BIRC2结合。正在开发针对癌症免疫治疗的LIGHT/TNFSF14抑制剂，也可以评估其用于HIV-1潜伏逆转的潜力。
此外，NSV参与者被发现上调了PIK3R1和PIK3CA（以及其他抗凋亡基因）的表达，这些基因编码磷脂酰肌醇3激酶，这是一种通过激活Akt促进细胞存活的酶。是否使用磷脂酰肌醇3激酶抑制剂可以有助于清除HIV感染细胞也应该探索。
在HIV-1病毒血症中，HIV特异性CD8+T细胞反应的增强对抑制HIV-1储藏库至关重要。因此，我们对发现的相对较弱的CD8+T细胞反应感到惊讶，NSV个体和接受ART治疗的个体之间在HLA限制的HIV特异性CD8+T细胞活性和增殖方面没有显著差异，与病毒血症相似的VCs相比水平明显较低。
综合转录组、可溶性炎症和T细胞数据表明，NSV似乎与免疫激活没有直接关联。HIV特异性T细胞反应水平较低可能有几个原因。首先，生产者原病毒携带了较高频率的适应性HLA逃逸突变，这可能解释了由于抗原识别的丧失导致HIV特异性CD8+T细胞活性的不足。
值得注意的是，nef中的HLA逃逸突变富集，这可能具有较强的免疫原性，先前的研究表明Nef特异性T细胞活性的强度与HIV-1储藏库的大小相关。另一个潜在的免疫逃逸机制可能是有缺陷的病毒颗粒对NSV的影响。
在我们的三分之一的NSV个体中，我们检测到了HIV-1基因组5′先导序列中的缺失。在VOA中未恢复这些序列，表明这些原病毒可能复制有缺陷。5′非编码先导包含多个结构基序，这些基序参与HIV-1复制的多个步骤。
这些缺失位于psi(Ψ)元素中，一个高度结构化的RNA序列，具有四个发夹茎环结构，对病毒Gag蛋白的核衣壳域有强烈的亲和力。病毒组装过程中的基因组封装和随后感染周期中的逆转录是5′前导区域的一些已知功能。
White等人最近的研究描述了四名具有明显5′先导序列缺陷的NSV参与者。这些缺陷通常涵盖主要剪接供体位点，并导致产生缺少包膜糖蛋白的非功能性病毒颗粒。有趣的是，我们NSV参与者中的5′先导序列缺失涵盖了同一区域，实际上，LV4与White等人检测到的三名参与者共有相同的22个碱基缺失。
在多个队列中高频率检测到5′先导缺陷表明这些原病毒在赋予NSV表型方面可能具有选择优势，可能是通过在没有HIV-1复制的情况下维持血浆病毒血症和/或Env缺失病毒颗粒逃避宿主免疫监视的能力。同时，越来越清楚的是，细胞代谢是T细胞激活和反应的关键调节因子。还需要进一步的研究来评估代谢程序和途径（如改变的谷氨酸代谢和糖酵解）在抑制NSV参与者中T细胞功能中的作用。
除了前面提到的局限性，这项研究中分析的NSV队列的小规模是一个重要局限。此外，我们通过近全长原病毒测序估计了原病毒储藏库的大小。这可能导致对实际储藏库大小的一些低估，尽管其他储藏库量化方法（例如，完整原病毒DNA测定）可能会高估其大小。
未来的研究需要调查组织储藏库中生产者原病毒的大小。我们发现，对NSV有贡献的HIV感染CD4+T细胞的外周血储藏库在NSV参与者之间可以有很大差异。有可能产生NSV的CD4+T细胞也分布在解剖组织隔间，特别是对于那些在外周血中有相对较小的生产者原病毒储藏库大小的NSV参与者。
先前的研究表明，Gag或CMV特异性抗原可以驱动某些HIV感染细胞克隆的扩展。需要进一步的研究来确定哪些抗原可能在生产者原病毒的扩展中发挥作用。中和抗体反应也可以抑制病毒血症，评估体液免疫反应是必要的，尽管先前的研究表明，一些NSV对自体中和抗体有抵耐药。
纵向系统发育分析上缺乏病毒进化和持续的病毒复制可能解释了为什么ART加强治疗没有在NSV个体中带来病毒学效果。目前尚不清楚是否新型抗逆转录病毒药物（ARVs），包括具有潜在免疫调节特性的药物（例如，fostemsavir）能提供额外的病毒学益处。
在这项研究中，我们确定了NSV的关键宿主和病毒介质，它们可能是干扰HIV-1持续性和促进病毒沉默的潜在目标。
值得注意的是，超灵敏的HIV-1病毒载量测定可以在大多数接受ART治疗的人类免疫缺陷病毒（PWH）中检测到残留的低水平HIV-1病毒载量，即便在表面上受到抑制的ART治疗下。先前的研究报告称，这种残余病毒血症主要由对药物敏感的病毒构成，且病毒群体相对同质。
因此，我们认为我们在这里描述的NSV背后的机制在大多数（如果不是所有）PWH中都存在。深入理解NSV背后的机制可能为适用于所有PWH的HIV-1储藏库根除策略提供洞见。
注释：
ART-AntiRetroviralTherapy（抗逆转录病毒治疗）：这是用于治疗HIV感染的药物疗法。
PWH-PeopleWithHIV（HIV感染者）：指那些被诊断为人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的人。
NSV-NonSuppressibleViremia（非抑制性病毒血症）：指即使在接受ART治疗的情况下，HIV病毒载量在血液中仍可检测到的情况。
IFN-InterFeroN（干扰素）：是一类在病毒感染和免疫反应中起重要作用的蛋白质。
CMV-CytomegaloVirus（巨细胞病毒）：一种广泛分布的病毒，可以在免疫系统受损的个体中引起严重疾病。
信息来源：https://doi.org/10.1038/s41591-023-02611-1
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