​破解HIV“藏身之谜”：病毒库研究为治愈之路指明方向

文章原名“淋巴组织在停止抗逆转录病毒治疗后早期对SIV感染恒河猴的血浆病毒克隆型的贡献”，作者为Antonio Solis-Leal等人。文章2023年12月13日发布在《Science Translational Medicine》上。这是一本专注于将科学发现转化为实际医疗应用的期刊。它由美国科学促进会（AAAS）出版，旨在促进跨学科的科学研究，特别是在基础科学与临床应用之间的交叉领域。

本研究旨在探索ART治疗中断后触发HIV病毒反弹的原因，特别是病毒群体的起源。研究通过使用带条码的SIVmac239M病毒株感染恒河猴，分析了血浆和多个组织中的病毒克隆型。研究发现，即使在血浆中病毒RNA含量极低的情况下，肠系膜淋巴结等次级淋巴组织可能是早期可检测到的病毒的主要来源。

通过多种技术（如单细胞RNA测序、RNAscope、免疫荧光分析）对病毒DNA和RNA进行了定量和定性分析，揭示了病毒在不同组织中的分布和潜在机制。这些发现有助于更好地理解HIV治疗失败的原因，为开发避免病毒反弹的新疗法提供了重要线索。

研究表明，即便在抗逆转录病毒治疗（ART）过程中，某些HIV病毒仍能存活并在治疗中断后（ATI）迅速复活，导致病毒量回升。这种情况，被称为反弹能力病毒库，是治疗HIV的主要挑战。为了减少这种病毒库的影响，我们需要更深入地了解ATI后哪些细胞和组织促使病毒反弹。

本研究中，科学家们使用了带有特殊条码的猴免疫缺陷病毒（SIV）感染恒河猴，以追踪ATI后血浆中出现的病毒。他们检查了恒河猴的血液和多种组织，如脾脏、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、结肠、小肠、肺、肝脏和大脑，采用了一系列先进的测序和分析技术。

结果显示，肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏中的病毒与血浆中的病毒相匹配。值得注意的是，CD4+ T细胞是ATI后携带病毒RNA的主要细胞类型。而且，在大多数动物中，淋巴组织中的T细胞区域病毒更为集中，比B细胞区域的病毒水平高。这些发现揭示了淋巴组织在治疗中断后早期对血浆中病毒的重要贡献，为开发新的治疗HIV的策略提供了重要线索。

即使HIV患者接受了长期的抗逆转录病毒治疗（ART），仍然存在一种病毒库，这种病毒具备在治疗中断后迅速反弹的能力，它是实现HIV治愈的最大障碍。虽然目前所有获批的ART方案都能有效阻止新的感染，但它们对于已经在体内休眠的HIV病毒无能为力。

一旦停止ART，这些休眠的病毒可能会重新活跃，导致病毒在体内传播和病毒量上升。如果不及时控制，这种病毒活动会逐渐导致免疫力下降和艾滋病，同时还有传播给他人的风险。因此，深入了解治疗中断后病毒反弹的原因、时间和机制，对于开发新的治疗策略，以缩小或消除这些病毒库至关重要。

所谓反弹能力病毒库，可能包括那些携带能够重新激活并引起有效感染的HIV病毒的细胞。除了淋巴组织，像生殖道、脂肪、肺和大脑这样的非淋巴组织虽然潜伏感染细胞较少，但也有可能成为HIV感染再次活跃的源头。尤其是淋巴组织，由于含有大量的CD4+ T淋巴细胞，在使用抑制性ART治疗期间成为了主要的HIV储藏地。

人类淋巴组织种类繁多，结构和功能复杂，比如人体内大约有800个淋巴结。我们认为，在ART治疗中断期间，那些藏有大量可复制HIV病毒并靠近CD4+ T细胞的淋巴组织可能是HIV反弹的主要来源。虽然理论上分析带HIV者体内病毒反弹的具体部位很有价值，但由于取样难度大，这在实际操作中几乎不可行。

目前大部分研究只分析了外周血中的反弹病毒，但血液中的病毒可能是多个不同组织贡献的混合体。因此，我们对ATI早期最初反弹病毒的真正起源知之甚少，急需对所有可能的HIV反弹病毒来源进行全面的研究。

为了更好地理解ART治疗中断后早期病毒反弹的来源，我们利用了恒河猴模型，这一模型可以对广泛的组织进行取样。在这项研究中，我们使用了一种特殊的猴免疫缺陷病毒（SIV），名为SIVmac239M，这种病毒经过基因修改，加入了一种由34个随机核苷酸构成的条码，这些条码位于vpx和vpr基因之间。

这种病毒库含有超过10,000种不同的病毒条码，允许我们跟踪和分析血液及组织中不同时间点的病毒克隆型。这些条码具有相似的复制能力，并在长时间的复制过程中保持稳定。这种方法已被用来定量分析和描述治疗中断后血浆中出现的病毒克隆型。

在本研究中，我们通过对早期ATI样本进行深入测序，比较了在尸检时在外周血、次级淋巴组织和非淋巴组织中检测到的病毒条码，从而识别出血浆和组织中共有的条码，进而推测出病毒反弹的潜在来源。

在本研究中，七只来自中国的恒河猴先后经历了两轮抗逆转录病毒治疗（ART）和治疗中断（ATI）。第一轮ATI主要是为了观察长期ART之后血浆中病毒反弹的时间和程度，以及外周血中病毒克隆型的变化。

此外，研究还关注了之前的ATI如何影响随后ATI后检测到的病毒条码。在第二次ATI一周后，所有恒河猴血浆中的病毒RNA含量仍低于每毫升22份。此时，对这些猴子进行了尸检，并对它们的多个组织（包括肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、脾脏、小肠、结肠、肺、肝脏和大脑以及血液）进行了一系列详细的检查，包括病毒条码测序、细胞相关DNA和RNA分析、完整原病毒DNA检测、结合索引共检测和RNAscope原位杂交、单细胞RNA测序等多种方法。

研究结果显示，在所有检查的组织中，肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏中的病毒条码与尸检时血浆中检测到的条码有重叠，这暗示了这些组织可能是ATI后病毒重新活跃和反弹的关键源头。

在病毒感染过程中评估了纵向血浆病毒载量感染、ART 和 ATI

本研究中，我们对感染了SIV的恒河猴进行了长期的血浆病毒载量监测（见图1）。病毒感染后的第二周，血浆中的病毒量达到高峰，范围在630万到2700万份/毫升。当在感染后第12周开始进行ART治疗时，猴子的血浆病毒载量已稳定在每毫升1200到26000份之间。

在本研究中，中国产恒河猴的慢性血浆病毒载量比先前报告的印度产恒河猴感染SIVmac239M的情况要低，这与之前中印两地恒河猴对SIVmac谱系病毒反应的比较结果相符。在进行了42周的ART治疗后，部分猴子在特定时间点（如20、24、28、36和40周）出现了轻微的病毒波动，但大多数时间血浆病毒载量低于81份/毫升的检测极限。

在ART治疗的特定阶段（28、32、36和40周）和在第二次ATI期间，使用更敏感的检测方法仍然显示病毒载量低于22份/毫升。在第一次ATI（53周）后，54周时血浆病毒RNA的数值在22份/毫升以下到103份/毫升之间。到了第57周，血浆病毒RNA的数值上升到每毫升347到20000份。

在短暂的3周治疗后，恢复ART治疗，血浆病毒载量迅速降至每毫升81份以下，并一直保持在22份以下，直到实施安乐死和尸检（第68至75周），这是在第二次ATI后的一周内进行的。

ATI-2 治疗 1 周时鉴定出血液中的病毒克隆型

在ART治疗中断的第二轮（ATI-2）的第一周，我们对血液中的病毒克隆型进行了识别。我们在急性感染期（第2周）、慢性感染/治疗前期（第12周）、第一次治疗中断期（第57周）和第二次治疗中断期（第68至75周）的血浆样本中进行了条码测序（见图2）。

由于使用了高剂量的SIVmac239M，因此在病毒感染的高峰期和慢性期检测到了多种不同的条码。但是，从感染高峰期到慢性期的10周内，以及在治疗前和两次治疗中断期间，检测到的克隆型数量显著减少。

在病毒高峰期，平均能检测到741个条码（范围为388到1519个），而在慢性期间，这一数字下降到平均只有77个（范围为10到217个），这可能反映了早期病毒动态和随机选择过程对病毒变体的影响。

在第一次治疗中断期（ATI-1），条码测序显示血浆中平均有8.3个病毒克隆型（范围为1到19个）。这些重新出现的病毒谱系大多数情况下出现在感染高峰期或慢性期的条码分布的前10%中。

在ART治疗中断的第二轮（ATI-2）期间，尽管所有动物的血浆中SIV RNA含量低于每毫升22份，但更精密的测序技术在四只动物（DJ01、EM77、EP15和KT12）（第1组）的尸检血浆样本中检测到了病毒条码序列。

在ATI-2期间血浆中检测到的病毒条码通常不是治疗前（pre-ART）的主要条码，有时甚至来源于较小的病毒谱系（例如EM77中的情况）。另外三只动物（KN41、LB66和LC31）（第2组）在ATI-2期间血浆中未检测到病毒条码。

此外，外周血单核细胞（PBMCs）中的细胞相关DNA（CA-DNA）也检测到了病毒条码序列，这些在ATI-1和ATI-2期间检测到的条码也在急性期和慢性期的PBMCs中被发现（参见图S1）。类似于血浆，所有受试者在不同时间点也检测到了多种病毒克隆型。

病毒克隆型多样性和完整原病毒的数量在 PBMC 中进行量化

在外周血单核细胞（PBMCs）中，我们对病毒克隆型的多样性和完整原病毒的数量进行了定量分析。我们发现，在ART治疗中断的第一轮（ATI-1）期间在血浆中发现的病毒条码克隆型，在对应的PBMCs中的频率，在第1组动物中普遍高于第2组（参见图3A）。

此外，根据完整原病毒DNA检测（IPDA）推断，PBMCs中完整原病毒库的大小在整个研究期间在第1组动物中也相对较大（参见图3B）。而且，先前在血浆中观察到的随时间减少的病毒条码克隆型多样性，在PBMCs的细胞相关DNA（CA-DNA）中也有所体现（参见图S1）。

在ATI-2期间淋巴组织比其他所有测试组织包含更多的克隆型。

在ART治疗中断的第二轮（ATI-2）期间，淋巴组织中的病毒克隆型数量超过了其他所有测试过的组织。我们对血液、淋巴组织（如肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏）、结肠、小肠、肺、肝脏和大脑中的细胞相关DNA和RNA的病毒载量进行了定量分析。

这些组织中大部分都显示出了可检测的病毒RNA或DNA（参见图S2）。我们进一步评估了每种组织中存在并表达的不同病毒克隆型的总数。结果显示，肠系膜淋巴结（平均44.0 ± 17.0）和腹股沟淋巴结（平均39.3 ± 33.8）中的克隆型数量最多，而脾脏（平均11.3 ± 5.6）、结肠（平均3.9 ± 7.0）、小肠（平均3.1 ± 7.5）、肺（平均1.1 ± 1.7）和肝脏（平均0.1 ± 0.4）中的克隆型数量较少（参见图4A）。

通过对细胞相关RNA产生的互补DNA进行序列分析，发现肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结的CARNA中也存在大量不同的病毒条码，与病毒DNA的情况相似。肠系膜淋巴结（平均8.7 ± 6.1）提供了最高比例的总体居住克隆型，其次是脾脏（平均6.1 ± 4.7）、腹股沟淋巴结（平均5.1 ± 7.2）、结肠（平均1.7 ± 3.4）、肺（平均1.0 ± 1.3）和大脑基底节（平均0.1 ± 0.4；参见图4B）。

此外，这些组织中检测到的病毒DNA中的克隆型数量与病毒RNA中的克隆型数量呈正相关（参见图4C）。

肠系膜淋巴结（MesLN）、腹股沟淋巴结（IngLN）和脾脏样本与ATI-2期间血浆中的大多数病毒条码相同

在ART治疗中断的第二轮（ATI-2）期间，肠系膜淋巴结（MesLN）、腹股沟淋巴结（IngLN）和脾脏样本中的大多数病毒条码与血浆中的条码相同。为了评估每种组织中不同克隆型的相对比例，并将其与第1组动物在ATI-1和ATI-2期间血浆中检测到的条码进行比较，我们对多个组织的病毒DNA进行了测序并识别出条码（见图5，A和B，以及图S3）。

总体来看，ATI-2期间血浆中检测到的克隆型在尸检时的肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏的DNA中的存在比例高于其他组织（见图5C）。同时，尽管与细胞相关DNA相比，在血浆中检测到的克隆型较少，但通过对细胞相关RNA中的病毒条码进行分析发现，ATI-2期间血浆中检测到的克隆型也更频繁地出现在肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏中，比例高于其他组织（参见图S4和S5）。

此外，尽管第2组动物KN41在ATI-2期间的血浆中未检测到病毒，但在尸检前的68 wpi时，血浆中确实发现了一些病毒条码。这一时间点的条码与尸检时在肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、结肠和肺中检测到的CA-DNA条码有重叠（参见图S6）。

在肠系膜淋巴结（MesLNs）和脾脏中发现了更大的病毒库

由于这些淋巴组织中包含了更多与ART治疗中断的第二轮（ATI-2）期间血浆中检测到的克隆型相重叠的克隆型，我们随后对肠系膜淋巴结和脾脏中估计存在的完整原病毒种群的大小进行了评估。

这两种组织中的CD4+ T细胞在所有动物中均显示出较高频率的完整原病毒，第1组动物中的病毒库大小超过了第2组（见图6A）。肠系膜淋巴结和脾脏中的CD11b+髓系细胞也含有完整原病毒（见图6B），但这些仅在每组的一两个动物中发现。

在肠系膜淋巴结（MesLNs）和脾脏中主要检测到CD4+ T细胞中的病毒RNA

虽然已有多项研究显示，在ART治疗期间淋巴组织中的CD4+ T细胞是主要的病毒库（参考文献4, 12–14），但我们希望确定在ART治疗中断的早期阶段（ATI-2）这些部位中哪些细胞类型在活跃地产生病毒RNA。

使用SIV RNAscope技术，我们发现CD4+ T细胞是主要产生病毒RNA的细胞类型（见图7A和图S7，A和B），而CD11b+髓系细胞产生的病毒RNA信号较少（见图S7，C至E）。接着，我们对所有七只动物的肠系膜淋巴结和脾脏中的病毒RNA进行了定量分析（见图S8）。

与脾脏相比，肠系膜淋巴结显示出显著更多的病毒RNA阳性细胞（P值为0.0426；见图7B）。这一结果与更大的完整原病毒库（见图6A）和肠系膜淋巴结中比脾脏更多的不同克隆型的发现相一致（见图4）。

接着，我们采用了Comb-CODEX-RNAscope技术来探究免疫细胞与病毒表达之间的空间关系。与我们此前在接受ART治疗的动物中的发现相似（参考文献12），我们在两组动物的肠系膜淋巴结中都轻松地检测到了病毒RNA（见图7，C和D，以及图S9）。

此外，我们还进一步确定了T细胞和B细胞区域中病毒RNA阳性细胞的空间分布情况。我们发现，对于大多数动物而言，T细胞区域的病毒RNA丰度高于B细胞区域。

在ATI-2期间血浆中检测到病毒条码的动物的肠系膜淋巴结（MesLNs）中多个基因表现出失调

为了了解在ART治疗中断的第二轮（ATI-2）期间血浆中有无可检测病毒条码的动物之间的潜在细胞机制差异，我们对从每组动物尸检时提取的肠系膜淋巴结（MesLNs）中分离出的细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和转录组分析。最初区分出了五个细胞群，其中四个被注释为B细胞、未经激活的T细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。

这些群体在两组之间的比例相似，只有一些小的差异，特别是在未经激活的T细胞比例上（见图8，A和B，及表S1）。我们在数据处理软件中将Louvain检测算法的分辨率参数从低分辨率（0.1）增加到高分辨率（2.0），以调整群体的数量（见图S10A）。

这种设置改变了下游群集的粒度，增加的值导致群体的更明显区分。这些群体进一步被注释为初始细胞群中的多个细胞亚群（见图S10B）。再次，所有群体都在两组中发现，这使得我们能够进行比较（见图S10C）。

在所有细胞亚群中，我们发现了91个差异表达基因（DEGs），其中许多基因与增强的免疫激活有关（参见表S2）。在第1组和第2组之间的所有亚群中，观察到最显著的对数倍数变化（LogFC）发生在滤泡辅助CD4+ T细胞的SPINK2基因（LogFC为4.369，调整后P值为0.037）和AFDN基因（LogFC为2.5403，调整后P值为0.045；参见表S3）。

在分析中列出的每个细胞亚群的所有DEGs中，大约有24个基因被认为在不同细胞群中表现出类似的失调。例如，COX7C、H2AC20和KCNQ5等基因在8至13个群体中被调节，涉及2.0分辨率分析下的多个B和T细胞亚群（见图8，C和D）。

特别是COX7C基因与线粒体功能障碍有关，在13个群体中表现出增加的表达，与线粒体过程和氧化应激相关的其他基因也出现中度失调。虽然KCNQ5基因在10个群体中表现出下调，但与其功能相关的其他基因未发生变化。与核小体和组蛋白修饰有关的H2AC20基因在八个群体中上调，并与此类别中其他失调的基因一起表现（参见表S2）。

为了促进HIV感染的治愈，更深入地理解ART治疗中断后引起病毒反弹的原始病毒来源至关重要，这可以帮助我们开发更有效的治疗策略，以减少或消除能引发病毒反弹的病毒库。

虽然Rothenberg等人（参考文献15）已经记录了在ART治疗中断后淋巴组织中病毒的多次复发，但我们还不知道在治疗中断后是否有特定的部位更容易首先发生病毒活化，而识别这些部位对于开发有效的干预措施可能非常有用。

考虑到有数百个淋巴结可能影响能引发病毒反弹的病毒库，它们位于不同的解剖位置并与不同的微环境相关，这些微环境可能导致不同的免疫激活状态，因此我们需要对多个淋巴组织以及可能促成早期病毒活化和反弹的非淋巴组织进行广泛的研究。

我们研究的局限性主要在于取样的时间点以及取样的组织数量和体积。然而，我们的研究试图探讨在系统性病毒传播变得可测量之前，是否能够确定病毒反弹的来源。通过比较ATI-2后一周内血浆、多种淋巴组织和非淋巴组织中可检测到的病毒克隆型，我们发现在血浆中检测到的病毒条码也出现在肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和脾脏中，这与这些组织可能促成ATI后的病毒重新激活和最终的病毒反弹的假设相符。

在早期ATI后立即进行尸检可能是更直接地分析最初反弹病毒量来源的方法，这有助于排除ATI-1后病毒可能的重新播种。然而，鉴于目前报道HIV感染者在遵守抗逆转录病毒治疗（ART）方面存在的问题，加上许多研究表明在ART抑制下，次级淋巴组织是主要的病毒库，我们的研究结果仍然具有重要的参考价值。

我们的数据还表明，这些次级淋巴组织中存在着一大批潜在具备复制能力的完整原病毒，这是通过IPDA分析推断出来的。这些组织中CD4+ T细胞的存在使得重新活化的病毒能够在局部扩散，并使得组织微环境具有特殊的特性。比如，肠系膜淋巴结负责排出肠道内容物，在HIV感染中比其他许多淋巴组织更容易免疫激活（参考文献17）。

肠系膜淋巴结显示出比脾脏更大的完整原病毒库和更高程度的病毒RNA表达。虽然在肠系膜淋巴结、脾脏和腹股沟淋巴结中检测到的病毒克隆型的数量比外周血单核细胞多，但在ATI-2期间血浆中检测到的大部分条码也能在PBMCs的CA-DNA中找到。我们无法确定这些血浆中的病毒克隆型是起源于PBMCs，还是这些淋巴细胞仅仅是从各种组织迁移而来。

此外，我们也不能排除ATI-2期间在血浆中检测到的病毒克隆型可能是由ART期间低水平的残留表达造成的，而不完全是由原病毒的新激活产生的。动物是通过静脉注射方式感染的，这增加了感染早期阶段外周血中病毒变异的多样性。但不管感染途径如何，病毒都可能会传播到相同的广泛解剖部位（参考文献21，22）。

另外，我们发现腹股沟淋巴结（IngLN）样本中存在与ATI-2期间血浆中相同的独特病毒克隆型，并在细胞相关DNA和RNA中表现出高多样性。这表明腹股沟淋巴结作为ART期间SIV持续存在的地点和潜在病毒复发的来源可能被忽视了（参考文献4）。鉴于腹股沟淋巴结相比肠系膜淋巴结更容易获取，对HIV感染者进行的临床研究可能会从采集腹股沟淋巴结中获得重要信息。

尽管之前的研究显示小肠中可能包含大量的SIV库（参考文献23，24），但在我们分析的小肠样本中，并没有发现ATI-2期间血浆中检测到的任何病毒条码，且第2组中只有一只动物在小肠中检测到了完整原病毒DNA。同样，在结肠样本中，也只有一只动物的病毒条码克隆型在ATI-2期间的血浆中被检测到。

在解释这一结果时，我们必须认识到，我们只能采样并分析胃肠道的极小部分。尽管胃肠道包含了体内大多数的淋巴细胞，但这些细胞在主要由非淋巴细胞组成的环境中不连续地分布，给采样带来了挑战。对每种组织进行更全面的采样和分析可能会进一步证实次级淋巴组织在早期病毒反弹中起主要作用的现有证据。

淋巴组织中病毒重新激活的促成因素，以及像肠系膜淋巴结（MesLNs）这样的淋巴组织中病毒复发的相关机制，仍需进一步研究。在这项研究中，我们通过对肠系膜淋巴结进行单细胞RNA测序分析，发现了两组之间的差异，包括线粒体功能和氧化应激相关基因的失调。

HIV或SIV感染与线粒体的失调相关，这可能导致ATP合成中断、氧化应激增加和细胞色素c的释放，从而引发HIV诱导的细胞凋亡（参考文献25，26）。另一方面，与核小体和组蛋白修饰相关的基因失调可能影响细胞的表观遗传学，可能改变转录因子的结合或细胞的转录组（参考文献27）。

HIV诱导的染色质重塑可能影响多个细胞途径，并在病毒库中促进潜伏状态（参考文献28-30）。肠系膜淋巴结中这种机制的失调有待进一步研究，以确定它是否是形成更大SIV库的潜在原因之一。我们的研究还发现，在ATI-2期间血浆中检测到病毒条码的动物中，KCNQ5基因表现出下调。

这是KCQN钾通道基因家族的一部分，虽然目前很少有研究表明KCQN5调节与HIV病程相关，但我们需要进行更多的研究来确定HIV或SIV感染后是否确实与某些细胞途径相关（参考文献31-34）。

对于HIV或SIV，减少或消除具有病毒反弹能力的病毒库被证明是非常有挑战性的，主要原因是含有完整原病毒的不同器官、组织和细胞之间存在显著差异。

诸如淋巴结和脾脏这样的次级淋巴组织是CD4+ T细胞的主要储存地，也是ART治疗期间HIV持续存在的主要地点，这一点已得到广泛的记录（参考文献4, 13, 35-40）。在这些组织中，携带有复制能力的病毒的CD4+ T细胞亚群包括中央、过渡和效应记忆T细胞，组织驻留的滤泡辅助T细胞，以及可能的未经激活的T细胞（参考文献2, 41-45）。

同样，髓系细胞也可能被感染，尤其是外周单核细胞和巨噬细胞（参考文献46-48）已显示出对HIV诱导的细胞凋亡具有抵抗力（参考文献49）。此外，微胶质细胞和脑血管周围的巨噬细胞也可能促使病毒在中枢神经系统中持续存在（参考文献2, 3）。

在ART治疗中断后出现的病毒反弹可能是由不同组织中的少量细胞引起的，这导致了反弹的多灶性起源（参考文献35, 50, 51）。为了更好地理解ATI后早期病毒重新激活和反弹的来源，在动物模型和人类中进行的更多研究可能有助于开发避免病毒反弹的治疗方法。

总结来说，我们的研究结果显示，次级淋巴组织，特别是肠系膜淋巴结，可能是ART治疗中断后血浆中非常早期可检测到的病毒的主要来源，即便血浆中的病毒RNA含量低于每毫升22份。

但是，还需要进行更多的研究来评估其他组织和器官可能的贡献。我们的研究还表明，尽管在动物和人类中都观察到了遍布全身的具备复制能力的原病毒，但一旦停止抑制性ART治疗，可能只有来自一个或多个组织的有限数量的病毒谱系会对血浆中最早期可检测到的病毒群体产生影响。

研究设计

本研究的目的是探究ART治疗中断后触发病毒反弹的病毒群体的起源。我们使用带条码的SIVmac239M来识别引起病毒反弹的克隆型。对组织进行了深度测序、IPDA、RNAscope、Comb-CODEXRNAscope和单细胞RNA测序分析。

动物在图兰国家灵长类动物研究中心饲养，严格遵循美国实验动物饲养协会标准、“国家研究委员会实验动物护理和使用指南”以及动物福利法。所有研究均获得图兰大学动物护理和使用委员会的批准。研究对象为七只中国产的恒河猴。这些实验的所有结果都包括在内，没有任何数据被排除。

动物在接种SIV之前对SIV、类D猿病毒和类T细胞白血病病毒均呈阴性。所有动物均接受了相同的处理程序，它们通过静脉注射感染了2.2 × 10^5感染单位的SIVmac239M。从感染后的第12周开始，动物开始接受包含替诺福韦酯、恩曲他滨和多替拉韦的ART治疗，每天通过皮下注射。

替诺福韦酯和恩曲他滨由吉利德科学公司通过物质转移协议提供，多替拉韦由ViiV医疗保健公司提供。ART治疗持续到感染后第53周，此时进行了第一次治疗中断（ATI-1）。治疗在第57周恢复，并持续到每只动物的尸检前一周。这一周的治疗中断被称为ATI-2。

样本收集和动物安乐死

我们按照图兰大学IACUC的标准操作程序和美国兽医医学会关于动物安乐死的指南，进行了动物的纵向血液样本采集和安乐死。动物首先被Telazol和丁丙诺啡麻醉，然后通过静脉注射致死剂量的硫喷妥钠。

在尸检时，我们收集了肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结、脾脏、结肠、小肠、肺、肝脏、大脑和血液样本。新鲜样本立即冷冻或储存在RNAlater溶液中（英维森，目录号AM7021）。次级淋巴组织被收集在RPMI 1640培养基（吉布科，目录号A10）和1×青霉素/链霉素溶液中（吉布科，目录号15-140-122），用于隔离淋巴细胞。

血浆中病毒RNA的定量

我们在EDTA处理的试管中收集了血液样本。血浆被分离出来并储存在-80°C的条件下。使用Macherey-Nagel NucleoSpin病毒试剂盒（目录号740956.50）提取了病毒RNA。通过使用先前描述的引物和探针（见表S4）进行的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR），对血浆中的病毒载量进行了两次测定。

所有样本的qRT-PCR检测限定为每毫升81份病毒。此外，为了进行更敏感的评估，我们在感染后的第28、32、36和40周以及尸检时的样本也进行了qRT-PCR检测，其检测限为每毫升22份病毒。

血液和组织中细胞相关的SIV DNA和RNA的定量

我们按照之前描述的方法（参考文献12），对外周血单核细胞（PBMCs）和组织中的RNA和DNA进行了处理。利用淋巴细胞分离介质（康宁，目录号25072CV）和氯化铵-氯化钾裂解缓冲液（吉布科，目录号A1049201）对PBMCs进行了15分钟的分离处理。对冷冻的PBMCs、次级淋巴组织中的淋巴细胞以及储存在RNAlater中的冷冻组织进行了基因组DNA和RNA的提取。

使用TissueRuptor II（启明星辰，目录号990890）以中速30秒的方式对每个30mg的组织样本进行组织均质化处理后，使用AllPrep DNA/RNA试剂盒（启明星辰，目录号80284）提取DNA和RNA。对DNA和RNA样本分别使用TaqMan通用PCR主混合物（应用生物系统，目录号43-057-19）和TaqMan RNA-to-CT 1-Step试剂盒（应用生物系统，目录号4392938）进行qRT-PCR反应。

通过输入600ng的样本，测定了细胞相关SIV DNA和细胞相关SIV RNA的含量。SIV拷贝数被标准化为每个细胞的二倍体基因组当量，使用TaqMan RNase P检测试剂盒（应用生物系统，目录号4316831）进行qRT-PCR共测定（参考文献12，53）。组织中qRT-PCR DNA和RNA检测的灵敏度为每百万细胞10拷贝。

条码病毒克隆型的深度测序

我们对所有样本进行了巢式PCR，对检测为阳性的样本进行了之前描述的深度测序（参考文献7）。我们处理了总共30mg的样本以提取DNA和RNA，并且每种组织都使用了相同的DNA和RNA输入量。进行测序的PCR采用了病毒特异性引物，结合了F5或F7 Illumina接头（参考文献9）。

通过与Illumina P5索引的精确匹配，将序列分离到各个样本中。然后，将序列与vpr基因的前28个碱基序列进行比对，允许两个核苷酸的不匹配。我们提取了vpr起始密码子上游的34个碱基，这些碱基对应于病毒条码。在模板量较低的样本中，使用单基因组扩增后的Sanger测序方法进行了测序（参考文献7）。

荧光活化单细胞分选和完整原病毒DNA检测

我们从脾脏和肠系膜淋巴结的分离淋巴细胞中，使用BD Biosciences的FACSAria III细胞分选机来分选CD4+辅助T细胞和髓系细胞。使用的抗体包括：CD8 Sk1 PerCP-Cy5.5（稀释比1:20，目录号565310）、CD11b ICRF44 PE（稀释比1:5，目录号562399）、CD3 SP34-2 APC（稀释比1:5，目录号557597）和CD4 L200 BV605（稀释比1:20，目录号562843）。

细胞用含0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，并在含0.2%牛血清白蛋白的FACS缓冲液中重悬。使用Fc受体结合抑制剂多克隆抗体处理细胞15分钟后，将细胞在4°C黑暗中染色30分钟，并再次洗涤两次。通过分选，我们回收了大约一百万个CD4+ T细胞和30万个髓系细胞（见图S11）。

我们按照上述方法从分选出的细胞中提取了基因组DNA，并按照先前描述的协议（参考文献54-57）进行了完整原病毒DNA检测（IPDA），使用Mancuso等人（参考文献56）描述的引物组。我们使用Cadena等人（参考文献4）描述的引物来定量保守基因RPP30，以计算DNA剪切指数（DSI）并将结果标准化为每10^6细胞的SIV拷贝数。

这些数据是根据Levy等人（参考文献57）描述的方法计算得出的。我们将800ng的基因组DNA、每个引物600nM、每个探针200nM以及无dUTP的ddPCR Supermix（Bio-Rad，目录号1863023）混合；使用5ng的样品来测量RRP30基因。

在计算出DSI后，我们将病毒拷贝数标准化为每10^6细胞的拷贝数。所有使用的引物和探针都列在表S4中。所有样本都进行了两次检测，结果进行了汇总。报告的样本滴计数超过10,000，SIV阳性样本的DSI低于0.38（见图S12）。数据使用QuantSoft软件版本1.7.4.0917（Bio-Rad）进行了分析。

NAscope和免疫荧光

我们使用RNAscope 2.5 HD检测试剂盒（高级细胞诊断，目录号322360）进行了RNAscope，该过程基于早期的报告（参考文献58）但进行了一些修改。

脱蜡的组织切片先在室温下用过氧化氢处理10分钟，然后用0.3M盐酸处理20分钟。接着在HybEZ杂交系统中，使用RNAscope靶向检索试剂（高级细胞诊断，目录号322000）在95°C加热20分钟，清洗并用蛋白酶加处理15分钟于40°C。

然后，我们将切片与SIV探针（高级细胞诊断，目录号416141）在40°C孵育2小时，并在1× SSC缓冲液中洗涤。在进行放大之前，我们按照制造商的协议使用了放大器1至6。组织随后被覆盖在稀释1:60的信号检测试剂中，在室温下孵育。当信号可见时，使用Milli-Q水停止反应，并用50%的赫马托克赛林在室温下染色8分钟，随后用0.02%的氢氧化铵溶液处理30秒。

使用Zeiss Axio Scan.Z1扫描幻灯片，并使用HALO多重IHC模块（版本3.4，Indica Labs）进行分析。

为了表征SIV感染的细胞，我们结合使用了RNAscope和免疫荧光检测方法。在完成上述放大器处理之后，我们用10%的普通山羊血清（Abcam，目录号ab7481）在室温下对组织切片进行了40分钟的封闭处理。

接着，将组织与1:10稀释的抗CD4抗体（Dako，目录号ab133616）和1:20/1:100稀释的抗CD68/CD206抗体（Dako，目录号M0814/Millipore-Sigma，目录号HPA004114）在4°C下孵育过夜。洗涤后，我们使用1:1000稀释的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647偶联的二级抗体对组织切片进行了染色。

最后，我们使用1:5000稀释的4′,6-二氨基-2-苯基吲哚核染色剂（EMD Millipore，目录号5.08741）对组织进行了5分钟的染色。使用Leica Stellaris共聚焦显微镜以63倍放大率拍摄了图像。

结合CODEX和RNAscope原位杂交

我们按照之前报告的方法（参考文献10）在单个切片上对来自尸检动物LC31、LB66、DJ01和EM77的甲醛固定石蜡包埋的肠系膜淋巴结（MesLNs）组织进行了CODEX和RNAscope原位杂交的结合研究。

简单来说，一个6微米厚的组织切片放置在载玻片上，经过脱蜡和水化处理，然后在室温下用3%过氧化氢处理10分钟，用柠檬酸缓冲液（pH 6，Sigma-Aldrich，目录号21545）煮沸15分钟，并在40°C下用RNAscope蛋白酶加（高级细胞诊断，目录号322331）处理20分钟。

随后，组织切片被用1:200稀释的含有DNA条码的抗体鸡尾酒进行染色，这些抗体由Akoya Biosciences提供（CD4/EPR6855、CD20/L26、CD68/KP1、Ki67/B56、CD21/EP3093、CD31/EP3095、HLA-DR/EPR3692），并由我们进行偶联（CD3/SP162）。

载玻片被放置在CODEX装置（由Akoya Biosciences提供）中，进行了多个周期的免疫染色和图像采集。接下来，组织载玻片被用于RNAscope程序，使用的是针对SIVmac239的RNAscope探针（反义链，由ACD公司提供）。

数据处理由CODEX处理器软件完成。我们使用CODEX多重分析程序（由Akoya Biosciences提供）进行了Voronoi空间分析，分析了病毒RNA在T细胞和B细胞区域的分布情况（分析的空间范围最小为3微米，最大为30微米）。

单细胞RNA测序和分析

我们从DJ01、EM77、KN41和LB66的肠系膜淋巴结中分离出的淋巴细胞，在FACSAria III细胞分选机（BD Biosciences）中使用LIVE/DEAD可修复水生死细胞染色试剂盒（Invitrogen，L34957）进行了分选。每只动物的1万个细胞被进一步单独处理，用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）的准备，这是根据Chromium Single Cell 3' Reagent Kits用户指南（v3.1 Chemistry Dual Index，10x Genomics）的指示制备的基因表达库。

库通过NovaSeq PE150（Novogene）进行测序，每个细胞的测序深度为50,000读取对。Fastq文件通过Cell Ranger（版本7.0.0）处理，使用了恒河猴参考基因组Mmul_10.106（Ensembl）和SIVmac239基因组（使用NBCI参考序列M33262），后者被分为五个部分（SIV_A至SIV-E）。这个单细胞RNA测序数据集通过Cellenics社区实例进行了处理、检查和可视化，该实例由Biomage托管。

在Cellenics中，我们采用了以下处理设置：基于emptyDrops方法（参考文献59），具有小于0.01的假发现率值的滴被识别为非空滴并保留。通过拟合线性回归模型，从基因数量与独特分子标识符数量的分布中移除了异常值（P值在7.91 × 10^−5和2.70 × 10^−5之间）。

使用scDblFinder方法（阈值范围为0.41至0.51）过滤掉了可能是双倍体的细胞。数据进行了对数正态化处理，并根据方差稳定化转换方法选择了2000个高变异基因。进行了互惠主成分分析，使用Seurat v4中的数据整合方法，应用了前30个主成分。计算了统一流形近似和投影嵌入。

使用Louvain方法识别了簇，初始分辨率设定为0.1，用以识别对应于大簇的主要细胞类型（见表S5），最终分辨率设定为2.0，用以进一步注释先前识别的细胞类型中的细胞亚型（见表S6）。未识别的簇之间没有显示任何组间差异基因表达。

统计分析

所有原始的、个别水平的数据都呈现在数据文件S1中。我们使用Shapiro-Wilk检验或Kolmogorov-Smirnov检验来测试数据的正态分布。通过HALO软件，使用非配对t检验比较了通过RNAscope技术在脾脏和淋巴结中每百万细胞中的SIV RNA阳性细胞。

使用Mann-Whitney检验比较了脾脏和肠系膜淋巴结中完整原病毒的IPDA结果。Spearman相关性检验被用来评估相关性研究。数据分析使用了GraphPad Prism 9.0.1统计软件（GraphPad软件公司），所有的统计检验都是双侧的，P值小于0.05被认为具有统计学意义。

注释：

ART - 抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral Therapy）。这是一种用于治疗HIV感染的药物治疗方法。

SIV - 猿免疫缺陷病毒（Simian Immunodeficiency Virus）。这是一种在非人灵长类动物中发现的病毒，与人类免疫缺陷病毒（HIV）类似。

SIVmac239M - 这是特定的SIV病毒株的名称，用于科学研究。

PBMCs - 外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells）。这是血液样本中的一种细胞类型，常用于免疫学和病毒学研究。

RNAscope - 这是一种分子生物学技术，用于检测和定位RNA分子。

CODEX - 这是一种用于生物医学成像的技术。

FACS - 荧光活化细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting）。这是一种用于分离和分析细胞的技术。

scRNA-seq - 单细胞RNA测序（Single-Cell RNA Sequencing）。这是一种分析单个细胞的RNA表达的技术。

DSI - DNA剪切指数（DNA Shearing Index）。这是评估DNA样本质量的一个参数。