超早期治疗：为HIV感染者开辟通往功能性治愈之路
发布日期：2024-05-20
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这张电子显微镜图像显示了人类 T 细胞（蓝色）受到 HIV（黄色）（导致艾滋病的病毒）的攻击
文章原名为“早期抗逆转录病毒治疗有利于治疗后SIV控制，与增强记忆CD8+ T细胞的扩张有关”，作者为Caroline Passaes等人。文章2024年1月11日发布在《Nature Communications》
上，《Nature Communications》是Nature出版集团的一部分，该集团出版多种高影响力的科学期刊。该期刊自2010年起出版，因其开放获取的特点，使得其发表的研究能够被全球的科学家和公众无障碍地阅读和引用，从而加速了科学信息的传播和科学进步的步伐。
本文介绍了一项关于SIV特异性CD8+ T细胞在早期和晚期接受治疗后的免疫反应研究。通过使用一系列特定的抗体标记和先进的染色技术，研究人员观察了这些细胞对SIV肽刺激的反应，包括它们的增殖、记忆功能和产生关键细胞因子（如IFNγ、TNFα、IL-2）的能力。
实验结果显示，早期治疗启动的CD8+ T细胞在ART（抗逆转录病毒治疗）中断后展现出更强的增殖和记忆反应，这表明早期介入有助于培养出具有更高反应性和持久性的免疫细胞。通过使用数据分析技术（如UMAP和PhenoGraph算法）进行的细胞聚类分析进一步揭示了治疗时机对细胞反应模式的影响。这些发现为理解CD8+ T细胞在SIV/HIV感染中的作用提供了深入见解，并为开发更有效的治疗策略提供了有价值的信息
虽然抗逆转录病毒治疗（ART）取得了明显的成功，但它无法彻底根除HIV藏匿处，这成为了彻底消灭HIV的一大障碍。因此，一旦中断ART治疗，多数HIV感染者很快会经历病毒的反弹。但是，有一小部分人，被称为治疗后HIV控制者（PTCs），在停止ART治疗后能长时间抑制病毒血症。找出能预测中断ART后病毒何时反弹的免疫或病毒学特征，并理解治疗后如何控制病毒，成为了开发持续HIV缓解新策略的关键。
一些因素，比如HIV DNA在细胞内水平低、CD4/CD8比例高、功能性浆细胞样树突细胞缺失或免疫检查点分子表达低等，与ART停止后病毒反弹延迟有关。治疗后控制者还显示出了特殊的转录组和代谢组特征。然而，ART中断后持久控制HIV的具体机制仍然是个谜。
VISCONTI 研究是第一个全面探索治疗后 HIV 控制者（PTCs）在病毒学和免疫学上的特点的研究，它表明治疗后能够控制病毒的免疫机制可能与自然控制 HIV 的人群中的机制不同。这项研究发现，如果在感染初期就开始进行抗逆转录病毒治疗（ART），并且持续数年，那么治疗后控制 HIV 的可能性会增加。
实际上，许多治疗后控制者是在 HIV 初期感染阶段就开始了治疗，虽然也有一些人是在感染的慢性阶段才开始治疗。CHAMP 研究也证实了这一点，发现在感染初期就开始治疗的人群中，治疗后能够控制病毒的比例比在慢性感染阶段开始治疗的人群要高。
早期治疗有助于减少病毒库的形成、病毒变异，减轻炎症反应，保护组织不受损害，同时保持免疫系统的响应。然而，即便在早期就开始了 ART，也只有少部分 HIV 感染者在停止治疗后能够控制病毒。
目前还不清楚，是否有一个最佳的 ART 开始时间，既能限制 HIV 库的形成，又不影响后期对治疗后控制可能重要的 HIV 特异性免疫反应的发展。由于研究的回顾性观察性质、治疗后长期控制病毒的个体较少、关于开始 ART 的时间、治疗方案的多样性、治疗前抗病毒治疗的持续时间以及不同研究对治疗后控制者定义的差异，评估早期 ART 的效果和确定导致治疗后控制的因素变得复杂。
非人类灵长类动物（NHP）的 SIV 感染模型非常贴近人类的 HIV 感染情况，涵盖了从病毒库形成、免疫反应发展到开始抗逆转录病毒治疗后的病毒演变等一系列事件。通过这些模型的研究，我们对 HIV 的发展机理、如何控制它以及在分析性治疗中断（ATI）之后如何延缓病毒反弹获得了深刻的理解，为未来的策略提供了可能的方向。
NHP 模型为我们提供了独一无二的机会，让我们在一致的实验条件下研究在 VISCONTI 研究中记录到的治疗后控制者（PTCs）中早期开始并持续数年的 ART 对结果的影响。因此，在这项研究中，我们比较了早期（感染后第4周）与晚期（感染后第24周）开始 ART 对感染 SIVmac251 的猕猴（CyMs, Macaca fascicularis）在停止治疗后的影响，并详细分析了 ART 前后的病毒学和免疫学特征。
我们发现，早期开始 ART 明显促进了猕猴在停止治疗后持续控制 SIV，这一成果与激活具有强大抗病毒功能的记忆 CD8+ T 细胞紧密相关。
早期 ART 启动有利于延迟病毒反弹和治疗后 SIV 控制者的高频率出现
早期开始抗逆转录病毒治疗（ART）有助于推迟病毒反弹，同时也发现治疗后能控制 SIV 的情况更为频繁。我们对比了在感染后4周和24周开始 ART 的猕猴，观察了停止治疗后病毒控制的效果。在进行了24个月的 ART 后，停止了治疗，并在接下来的24到48周内对动物进行了观察。所有动物在最初感染 SIV 时都有高病毒载量，感染后10天达到最高点。
不管是早期还是晚期开始治疗的动物，它们的病毒高峰值之间没有显著差异。在 ART 启动期间，早期治疗组的动物是在病毒量开始下降时开始治疗，而晚期治疗组的动物在开始治疗时病毒量已经稳定。但是，在开始治疗时，两组动物的病毒载量大致相同。
其中一只早期治疗组的动物因严重的急性感染被安乐死，一只晚期治疗组的动物在开始治疗前病毒量已经被控制在较低水平，这两只动物后来被排除在了进一步的分析之外。治疗有效地抑制了病毒量，并且两组动物达到病毒量不可检测的时间相近。
在停止治疗时，早期和晚期治疗的动物病毒量相似，而在血液或周围淋巴结中与细胞相关的 SIV RNA 水平也没有差异。这表明，不管是早期还是晚期开始 ART，都能有效控制病毒，但早期治疗似乎更有助于长期控制 SIV。
在停止治疗后，我们发现早期和晚期开始治疗的两组猕猴在病毒载量（pVL）变化上有很大的差异。总的来说，除了两只早期开始治疗的猕猴保持了较低的病毒量外，所有的动物都经历了病毒反弹，病毒载量迅速升高，超过了1000拷贝/mL。
在早期治疗的动物中，病毒反弹发生的时间比晚期治疗的动物晚了两周（早期治疗组中病毒反弹的中位时间为停止治疗后28天，而晚期治疗组为14天），这一差异非常显著。此外，在停止治疗后病毒反弹的所有观察时间点上，早期治疗组和晚期治疗组的病毒载量差异显著。
停止治疗后，晚期治疗的猕猴病毒载量的峰值更高，所有这些动物的病毒载量都超过了10,000拷贝/mL，而且他们的累积病毒量也比早期治疗的猕猴更高。大多数早期治疗的猕猴病毒载量随时间逐渐减少，但大多数晚期治疗的动物病毒载量则保持在较高且相对稳定的水平。
在研究快要结束时，接受早期治疗（W4）的11只动物中有9只（82%）成功控制了病毒载量，使其低于400 SIV-RNA 拷贝/mL，达到了治疗后控制者（PTC）的标准。相比之下，晚期治疗（W24）的动物中只有2只（18%）达到了这一标准（图 1G）（p = 0.008）。
所有的 PTCs 在病毒反弹后至少有两次病毒载量测试结果低于400拷贝 RNA/ml，除了一只（最后的病毒载量为514 RNA/ml）之外，所有的 PTCs 直到研究结束都保持了病毒载量低于400拷贝。另外，我们并行研究的17只未经治疗的猕猴中，只有2只（12%）自然地将病毒载量控制在400拷贝/ml以下，而其他15只则保持了较高水平的病毒血症（超过10,000拷贝/ml）。
虽然我们的研究没有包括那些在这个模型中自然有利于控制 SIV 的 M6 MHC 等位基因型的动物，但我们不能排除其他免疫遗传因素对治疗中断结果的可能影响。
然而，本研究的早、晚期治疗组是根据它们的 MHC 等位基因型进行匹配的，因此，这两组之间的主要差异主要是由于治疗开始时间的不同。我们的发现表明，相比于晚期开始治疗或模型中观察到的自然控制病毒的情况，早期（感染后第4周）开始并持续两年的 ART 明显提高了治疗后控制 SIV 的可能性。
图1 早期治疗与治疗后控制者的较高比率相关。血浆病毒载量动态 A 在 ART 启动前和治疗期间；以及 B 在治疗中断后的 ATI 中，对于早期治疗（W4-treated，n = 11）和晚期治疗（W24-treated CyMs，n = 11）的猕猴。作为参考，展示了未接受 ART 的动物在感染后最初六个月内的血浆病毒载量动态（n = 17）。展示了中位数和四分位距（IQR）。C 在急性感染的高峰时期、ART 启动时以及治疗中断前，比较了 W4 和 W24 治疗的猕猴之间的血浆病毒载量水平。D 比较了 ATI 后早期 W4 和 W24 治疗的猕猴之间的血浆病毒载量水平。通过（E）病毒载量高峰和（F）ATI 后累积 pVL（曲线下面积 - AUC，考虑到 ATI 后6个月内的所有 pVL 测量值）指出了 ATI 后 W4 和 W24 治疗的猕猴的血浆病毒载量的幅度。C–F 显示了个别动物的值（W4 n = 11, W24 n = 11）和中位数。*p < 0.05, **p < 0.01; ***p < 0.001; ns - 非显著性；使用双侧 Mann‒Whitney U 检验。G Kaplan‒Meier 分析，在 ART 中断后维持无病毒反弹的时间（左侧，不超过 pVL > 400 拷贝/ml）和实现治疗后控制的时间（右侧，病毒反弹后持久 pVL <400 拷贝/ml）在 W4 和 W24 治疗的猕猴中（每组 n = 11）。在未经治疗的 SIV 感染中和抗逆转录病毒治疗中断后，自发控制血浆病毒血症（<400 拷贝/mL）的猕猴频率（中间和右侧面板）。展示了 W4 和 W24 治疗的猕猴中治疗后控制者的频率。使用 Mantel Cox log-rank 检验比较两组。源数据作为源数据文件提供。
早期治疗可降低 SIV 储存水平并在治疗中断后保留 CD4 + T 细胞
我们研究了抗逆转录病毒治疗（ART）开始的时间点是否会影响治疗停止前的 CD4+ T 细胞数量和 SIV-DNA 的水平，以此来解释为什么在治疗后病毒反弹的情况会有所不同。
研究发现，CD4+ T 细胞中 SIV-DNA 的含量与血液中的病毒量变化密切相关。在早期和晚期接受治疗的猕猴中，我们在原始 SIV 感染期间检测到较高水平的 SIV-DNA。
如我们所预料，早期治疗组的猕猴在治疗开始时 SIV-DNA 水平较高，因为这些动物还处于从原始感染到慢性感染的过渡期。相比之下，在晚期治疗组的动物中，治疗开始时血液和周围淋巴结的 SIV-DNA 水平较低。
但在治疗中断时，早期和晚期治疗组之间的 SIV-DNA 水平并没有差异。停止治疗后，尤其是在晚期治疗的动物中，SIV-DNA 水平出现了上升，研究结束时，这些动物的血液和淋巴结中的 SIV-DNA 水平比早期治疗的动物要高。
为了考虑到不同治疗组内可能出现的不同结果的动物，我们对比了无论 ART 开始时间如何，在治疗后停止治疗的 PTC（治疗后控制者）和非 PTC 动物。在原始感染期间或治疗停止前，PTCs 和非 PTCs 之间在血液或淋巴结的 SIV-DNA 水平没有显著差异。在停止治疗后，非 PTCs 的 SIV-DNA 水平大幅上升，达到了治疗开始前的水平，而 PTCs 的水平则保持在治疗期间的水平附近。
在早期和晚期接受治疗的猕猴中，我们发现它们在原始 SIV 感染期间的 CD4+ T 细胞数量变化并没有差异。具体来说，在感染后的第7天，血液中的 CD4+ T 细胞数量达到了最低点。在开始治疗的时候，晚期治疗组的动物血液中的 CD4+ T 细胞数量似乎更少，周围淋巴结中的 CD4+ T 细胞比例也更低。但是，当治疗停止时，我们并没有在这两组动物的血液和周围淋巴结中发现 CD4+ T 细胞数量的差异。
治疗中断后，在最初的几周内，CD4+ T 细胞数量并没有减少，但晚期治疗组的动物逐渐显示出 CD4+ T 细胞数量的下降，特别是在治疗中断后的第24周，血液、周围淋巴结以及其他被分析的淋巴和非淋巴组织（如骨髓、肠系膜淋巴结、脾脏、结肠黏膜和支气管肺泡灌洗液）中，这一组与早期治疗组的差异显著。
总体上，无论治疗开始的时间早晚，治疗后控制者（PTCs）在研究结束时都保持了较高水平的 CD4+ T 细胞，无论是在血液还是在组织中。这种差异并不是由于原始感染期间或治疗中断时的情况，而是在 PTCs 和非 PTCs 的猕猴之间普遍存在。
我们对早期和晚期开始抗逆转录病毒治疗（ART）对 T 细胞群体的影响做了更深入的分析，特别是观察了 CD4/CD8 比例和血液以及组织中中央记忆型 CD4+ T 细胞的比例，这两个指标在之前的研究中被认为与治疗后控制密切相关。
不出所料，所有动物在 SIV 感染后都表现出 CD4/CD8 比例的逆转。经过两年的 ART 治疗，这一比例无论治疗开始的时间早晚都恢复正常，在治疗中断时，早期和晚期治疗组之间没有差异。
然而，当 ART 停止后，晚期治疗组的 CD4/CD8 比例显著下降，在研究结束时，与早期治疗组相比，晚期治疗组在淋巴结、脾脏和结肠的 CD4/CD8 比例更低。同样地，研究结束时，我们在早期治疗的动物的血液和组织中发现了更高频率的中央记忆型 CD4+ T 细胞。
图2 治疗后控制者能够保持较低的感染细胞数和较高的 CD4+ T 细胞比例。我们研究了早期和晚期治疗猕猴的血液和周围淋巴结中 SIV-DNA 的变化，结果按照每百万 CD4+ T 细胞中的 SIV-DNA 拷贝数来表示。在动物被安乐死时，我们还测量了肠系膜和腹股沟淋巴结中的 SIV-DNA 水平，这些结果以每百万细胞中的 SIV-DNA 拷贝数展示。此外，我们追踪了血液和周围淋巴结中 CD4+ T 细胞的数量变化，以及在骨髓、肠系膜淋巴结、脾脏、结肠黏膜和支气管肺泡灌洗液中 CD4+ T 细胞占 CD3+ 淋巴细胞的比例。我们还观察了血液中 CD4/CD8 比例的变化，并在安乐死时测量了多个组织中的 CD4/CD8 比例。特别地，我们研究了中央记忆 CD4+ T 细胞在多个组织中的比例。这些数据反映了不同治疗阶段的样本，包括个体值和中位数。我们使用了双侧 Mann‒Whitney U 检验来分析数据，结果显示有些指标在统计上显著。这些发现的源数据已经作为一个数据文件提供。
暴露于病毒血症后抗 gp140 抗体反应的强度
我们进一步研究了早期开始抗逆转录病毒治疗（ART）是否对猕猴在原始感染期间适应性免疫反应的成熟产生了影响，这种成熟可能随后帮助控制了病毒的反弹。为此，我们首先检查了早期和晚期接受治疗的猕猴血浆中，针对 SIV Env 抗体水平随时间的变化情况。
我们在感染后的第4周发现，无论是早期还是晚期治疗的猕猴，他们的抗 gp140 IgG 滴度都相似且较低。开始治疗阻止了这些动物产生更多抗 SIV Env IgGs，而在晚期接受治疗的猕猴中，抗体滴度却持续上升。治疗启动后，所有动物的抗 gp140 IgG 滴度都有所下降，但治疗中断前，晚期治疗组的动物检测到更高的 IgG 滴度。
在治疗中断后的病毒反弹中，除了一只在早期治疗组中未出现明显病毒复发的猕猴外，所有动物的 IgG 滴度都急剧上升。相比感染后，ATI之后IgG滴度的上升速度在两组猕猴中都更快。整体而言，ATI后24周内，晚期治疗的猕猴的抗 SIV IgG 反应总体水平显著高于早期治疗的猕猴，并且不管 ART 的开始时间如何，非治疗后控制者（非PTCs）的IgG水平都比治疗后控制者（PTCs）高。此外，综合所有动物的数据，我们发现ATI后的IgG滴度与病毒反弹的幅度有正相关性。
在感染后的第4周，我们没能在早期或晚期接受治疗的猕猴中检测到显著的抗 SIV gp140 IgA 抗体水平。然而，到了感染后第24周，我们在晚期治疗组的动物中检测到了抗 gp140 IgA 抗体。在进行了两年的抗逆转录病毒治疗（ART）之后，抗 SIV Env IgA 的水平没有从基线水平上发生变化，且在治疗中断前，早期和晚期治疗组之间也没有差异。
与抗 gp140 IgG 抗体滴度相似，IgA 抗体滴度在治疗中断后的增加速度比在原始感染期间要快。但是，不管是早期还是晚期治疗的动物，治疗中断后抗 SIV Env IgA 抗体的整体水平之间并没有观察到差异。不同于 IgG 抗体水平，我们没有发现治疗中断后抗 gp140 IgA 抗体水平的幅度与病毒反弹的幅度之间存在相关性。
总体而言，这些研究结果显示，SIV Env 特异性的记忆 B 细胞在长时间的治疗中依然存在，并且在治疗停止后因病毒反弹而再次被激活，从而快速启动了抗体反应。虽然抗 Env 的 IgG 和 IgA 抗体并不能有效阻止病毒的反弹，但我们还需要进一步的功能性分析来评估开始抗逆转录病毒治疗对 SIV 特异性 IgA 和 IgG 反应品质的影响。
图3 治疗停止后的抗 SIV 抗体水平与抗原刺激的强度有关。我们研究了早期和晚期治疗的猕猴血浆中抗 gp140 SIV IgG 和 IgA 抗体的变化情况。在治疗开始的基线时刻、感染后第28天、对于晚期治疗组感染后6个月，以及在即将停止 ART 治疗前，我们比较了早期和晚期治疗组猕猴之间的抗 gp140 SIV IgG 和 IgA 水平。我们通过计算治疗中断后6个月内血浆中抗 gp140 SIV IgG 和 IgA 的累积测量值（曲线下面积 - AUC）来指示体液反应的整体强度。通过 Spearman 相关性分析，我们研究了治疗中断后病毒载量（pVL AUC）与抗 gp140 SIV IgG 和 IgA AUC 之间的关系。这些数据包括了每个治疗组11只动物的个体值。我们展示了这些数据的中位数，并使用双侧 Mann‒Whitney U 检验进行了统计分析，结果显示了显著性的不同水平。所有的源数据都被提供在一个数据文件中。
早期治疗增强了 CD8+ T 细胞在 ART 中断后抑制 SIV 的能力
我们进一步通过研究 CD8+ T 细胞在体外抑制同源 CD4+ T 细胞中的 SIV 感染能力，来评估 SIV 特异性 CD8+ T 细胞的功能。这种方法帮助我们发现了在自然控制 HIV 和 SIV 的个体中存在的高效 CD8+ T 细胞。
在原始感染阶段，CD8+ T 细胞在血液和周围淋巴结中展示出较弱的 SIV 抑制能力。在感染后第4周，无论是早期还是晚期治疗组，血液中的 CD8+ T 细胞介导的 SIV 抑制活性并未显示出与治疗前的基线水平有所不同。这表明原始感染期间激活的 SIV 特异性 CD8+ T 细胞的抗病毒能力有限，这与我们之前在 HIV 感染者和 SIVmac251 感染的猕猴中的发现相一致。
在晚期治疗组中，随时间推移，CD8+ T 细胞介导的 SIV 抑制活性有了轻微但显著的提升。抗逆转录病毒治疗的开始并未立即改变 CD8+ T 细胞抑制 SIV 感染的能力，但我们在治疗停止前的早期治疗猕猴中看到了向更高 SIV 抑制活性倾斜的趋势，尤其是在周围淋巴结中这一差异更加明显。
治疗停止后，无论是早期还是晚期接受治疗的猕猴组，在血液和周围淋巴结中，CD8+ T 细胞抑制 SIV 感染的活性都有显著的提升。在治疗中断后的24周期间，早期治疗组的 CD8+ T 细胞介导的 SIV 抑制活性整体上倾向于更高，尤其在此期间，ART 停止后 CD8+ T 细胞达到的 SIV 抑制活性最高水平在早期治疗组中超过了晚期治疗组。研究结束时，在早期治疗组的猕猴中，周围淋巴结的 CD8+ T 细胞展现出更强的 SIV 抑制能力。
与无论 ART 开始时间的非治疗后控制者（非PTCs）相比，治疗后控制者（PTCs）的血液、周围淋巴结和脾脏中的 CD8+ T 细胞显示出更强的抑制 SIV 感染的能力。当将所有动物的数据综合考虑时，治疗中断后血液中的 CD8+ T 细胞介导的 SIV 抑制活性总体上与病毒反弹的幅度呈现负相关，或与携带 SIV-DNA 的 CD4 细胞的频率呈现负相关。此外，研究结束时，周围淋巴结中的 CD8+ T 细胞抑制 SIV 感染的能力与病毒载量或感染细胞的频率也显示出负相关性。
我们的研究发现，持续的抗逆转录病毒治疗（ART）有助于增强 CD8+ T 细胞的抗病毒能力，使这些细胞在病毒反弹时展现出比原始感染期间更强的作用。特别是在治疗后控制者（PTC）的猕猴中，这种效果更加显著，这些猕猴的 CD8+ T 细胞在血液和淋巴组织中展现出更高的 SIV 抑制能力，而且这种能力通过早期开始的 ART 得到了增强。这些发现表明，CD8+ T 细胞在限制病毒反弹和减少感染细胞数量方面扮演了重要角色，并且可能与建立治疗后的 SIV 控制有关。
图4 在早期治疗停止后，CD8+ T 细胞展示了更强的 SIV 抑制效果。我们研究了早期和晚期治疗的猕猴在原始 SIV 感染和治疗停止后血液中的 CD8+ T 细胞抑制活性的变化。我们还比较了这两组猕猴在治疗开始时、感染后28天、晚期治疗组的感染后6个月，以及治疗停止前的 CD8+ T 细胞的 SIV 抑制效果。我们发现，在治疗停止后的一段时间内，早期治疗组的 CD8+ T 细胞达到的 SIV 抑制活性的最大值高于晚期治疗组。此外，我们通过累积测量（直到治疗停止后6个月的所有测量值的曲线下面积 - AUC）来评估 CD8+ T 细胞的 SIV 抑制效果的整体强度。我们还观察了 ART 开始时、治疗停止后14天和研究结束时，早期和晚期治疗组的猕猴的周围淋巴结中的 CD8+ T 细胞抑制活性的变化。我们的分析还包括了血液中 CD8+ T 细胞的 SIV 抑制活性与病毒载量的相关性，以及周围淋巴结中 CD8+ T 细胞的抑制活性与病毒载量和感染细胞频率的相关性。这些数据展示了个体值和中位数，并通过双侧 Mann‒Whitney U 检验进行了统计分析。所有的源数据都提供在一个数据文件中。
早期开始的 ART 中断后导致了弱激活记忆 CD8+ T 细胞的增加
为了深入理解原始 SIV 感染期间和 ART 停止后在同一动物体内观察到的 CD8+ T 细胞抗病毒能力的明显差异，我们对比了这些阶段 CD8+ T 细胞的表型特性。我们首先检查了细胞的激活情况，即评估了同时表达 CD38 和 HLA-DR 的 CD8+ T 细胞的比例。
一致于先前对人类和 NHP 模型的研究发现，我们注意到所有动物在原始 SIV 感染期间 CD8+ T 细胞展现出非常强烈的激活状态。在接受晚期治疗的猕猴中，这种激活状态的细胞比例保持较高且相对稳定，但在 ART 开始治疗的早期和晚期治疗动物中，CD8+ T 细胞的激活迅速降低了。ART 停止后，我们在接受晚期治疗的组中看到 CD8+ T 细胞激活迅速上升，达到了与原始感染期间相似的水平。
相比之下，早期治疗组的动物几乎没有或只有少量的 CD8+ T 细胞激活。从原始感染到 ART 停止后，早期治疗的猕猴的 CD8+ T 细胞整体激活水平较低，而晚期治疗组则没有明显差异。研究末期，晚期治疗组动物的周围淋巴结中 CD8+ T 细胞激活水平似乎更高。我们没有发现 CD8+ T 细胞的激活水平与它们在 ART 停止后抑制 SIV 感染的能力之间有相关性。
在原始 SIV 感染期间，我们也发现了正在增殖的 CD8+ T 细胞（表达 Ki67 标记）的高频率。这些细胞在接受晚期治疗（感染后24周）的动物中随着转入慢性感染阶段而减少，直到 ART 开始治疗前保持稳定，随后在所有案例中 ART 开始后大幅减少。
与原始感染期相比，治疗中断后的增殖 CD8+ T 细胞（表达 Ki-67）在早期和晚期治疗的动物中都显示出较低的水平，但在治疗中断后早期，早期治疗的猕猴的血液和周围淋巴结中的这类细胞水平总体上高于晚期治疗的猕猴。特别是，我们发现 ART 停止后增殖 CD8+ T 细胞的比例与它们在同一时间段内抑制 SIV 感染的能力呈正相关。这表明，动员后的 CD8+ T 细胞的增殖状态与它们抗病毒功能的强度有关。
我们进一步研究了原始 SIV 感染期间与治疗中断后 CD8+ T 细胞亚型之间的差异。在原始感染期间，主要是效应记忆（EM）或效应型 CD8+ T 细胞的扩张。与此相对，中央记忆（CM）型 CD8+ T 细胞在早期治疗的猕猴中治疗中断后扩张，而 EM 和效应型 CD8+ T 细胞的比例则较低。
早期治疗的猕猴在治疗中断后相较于原始感染期间，在周围淋巴结中有更多 CM CD8+ T 细胞。对于在感染后24周接受治疗的动物，治疗中断后又一次观察到血液和周围淋巴结中 EM 和效应型 CD8+ T 细胞的扩张。在治疗中断时，早期和晚期治疗组之间的 CM CD8+ T 细胞比例没有差异，但在治疗中断后14天，早期治疗组的猕猴血液和周围淋巴结中 CM CD8+ T 细胞出现得更频繁。
此外，在治疗中断后，早期治疗组的猕猴血液和周围淋巴结中的 CM CD8+ T 细胞显示出更高的增殖水平。治疗中断后血液和周围淋巴结中 CM CD8+ T 细胞的比例与 CD8+ T 细胞抑制 SIV 感染的能力在同一时间点呈正相关，显示出 CD8+ T 细胞的这一亚群在抑制病毒方面可能起到了关键作用。没有发现 CD8+ T 细胞抑制 SIV 感染的能力与幼稚、过渡记忆或效应记忆 CD8+ T 细胞比例有关联，但与效应型 CD8+ T 细胞的比例呈现出负相关趋势。
因此，虽然在原发感染期间扩展的效应 CD8+ T 细胞具有强烈的激活但抗病毒潜力有限，早期和持续的 ART 似乎促进了具有中央记忆特性的 CD8+ T 细胞的保留或发展，这些细胞能够在 ART 中断后迅速扩展，并施展有力的抗病毒活动，同时激活程度有限。
在早期治疗的猕猴中，ART 中断后动员了具有增强生存和增殖能力的 SIV 特异性 CD8+ T 细胞。
我们进一步研究了在实验室条件下对 SIV 肽反应的 CD8+ T 细胞的特性。在所有检测的动物中，我们在原始 SIV 感染后发现了能够产生干扰素γ、肿瘤坏死因子α或白细胞介素2，或在接受 SIV 肽刺激6小时后表达 CD107 的 SIV 特异性 CD8+ T 细胞。
正如我们所预期的，这些 SIV 特异性 CD8+ T 细胞在接受抗病毒治疗（ART）期间数量下降，但在病毒反弹后数量开始逐步上升，并且在开始治疗前或停止治疗后，早期和晚期接受治疗的动物中这些细胞的功能或数量上没有显著差异。
我们没有发现在原始感染期间与停止治疗后，SIV 特异性 CD8+ T 细胞的功能或数量上有任何差异，这并不能解释为什么在所有猕猴停止治疗后我们看到了 CD8+ T 细胞的抗病毒活性显著提高。
然而，我们注意到，在停止治疗后，早期治疗的猕猴中的 SIV 特异性 CD8+ T 细胞比晚期治疗的猕猴有更高的 IL-7 受体（CD127）表达水平，暗示早期治疗组可能有更多的长期存活的记忆细胞。此外，无论是治疗后控制者（PTC）还是非治疗后控制者（非PTC），SIV 特异性 CD8+ T 细胞的数量上没有差异；但是，治疗结束时，前者的这些细胞显示出更高的 CD127 表达水平，指示了它们可能具有更好的生存和增殖能力。
进一步研究在这个时间点的 SIV 特异性 CD8+ T 细胞的记忆特性发现，早期治疗的猕猴中的记忆型（CD45RA负）SIV 特异性 CD8+ T 细胞表现出更高的 CCR7 和较低的 CD39 表达，这使得它们与晚期治疗的猕猴中的细胞有所区别。我们还注意到一种趋势，即早期治疗的猕猴中的细胞中，与细胞干性相关的转录因子 TCF-1 的表达较高。
尤其在被分类为治疗后控制者（PTC）与非治疗后控制者（非PTC）的动物中，SIV 特异性记忆 CD8+ T 细胞上 CCR7 和 TCF-1 的表达更加明显。与此相反，非治疗后控制者的细胞特征是 PD-1 水平较高。这些发现进一步证明了，在早期治疗的动物中，ART 中断后存在一大部分具有长期存活和类似干细胞特性的记忆 SIV 特异性 CD8+ T 细胞，而在晚期治疗的动物中的细胞表现出更多分化和易于耗竭的特征。
为了更深入地理解 SIV 特异性 CD8+ T 细胞的记忆功能，我们在实验中的不同阶段对早期和晚期治疗的猕猴的 CD8+ T 细胞进行了 SIV 肽的体外刺激测试，并检测了这些细胞在6天的时间内的增殖反应。
结果显示，与晚期治疗相比，早期治疗后的猕猴中的 SIV 特异性 CD8+ T 细胞在 ART 中断后具有更强的分裂和增殖能力。特别是，这些细胞在 ART 中断后的增殖能力超过了它们在原始感染期间的表现。通过使用 Phenograph 聚类分析方法，我们进一步探讨了这些特定细胞的性质，发现了7种潜在的 SIV 特异性 CD8+ T 细胞群体。
在早期治疗的猕猴中，某些细胞群体在治疗中断后变得更为常见，而另一些则减少，这与治疗前的情况相比较。特别地，我们观察到某些细胞群体在表达与长期存活和干细胞特性相关的标志物方面有所不同，例如较高的 IFNγ 和激活标志物 pS6，以及与 ART 中断后更常见的细胞群体相关的高水平 CD127 和 TNFα。
所有这些细胞群体都显示出高水平的 pAKT，指示着 mTORC2 路径的激活。值得一提的是，我们最近的研究将 TNFα 的持续产生与 CD8+ T 细胞的干细胞性和记忆潜力联系起来，这种特性在自然控制 HIV 感染的个体中较为常见。
简而言之，我们的研究发现，在 SIV 感染的猕猴中早期开始抗病毒治疗有利于培养出一种特殊的 CD8+ T 细胞。这些细胞类似于记忆细胞，具有更好的增殖和生存能力，能够在停止治疗后有效地应对病毒的再次活跃。这表明，在接受抗病毒治疗期间，这些特定的 CD8+ T 细胞的记忆功能与治疗后成功控制 SIV 有一定的联系。
图5 早期治疗停止后增加的 CD8+ T 细胞展现了较低的激活标志物水平。在原始 SIV 感染期间和治疗停止后，我们检测了早期和晚期治疗的猕猴血液中的 CD8+ T 细胞的激活标志物 CD38 和 HLA-DR 以及增殖标志物 Ki67 的表达水平。我们还分析了 SIV 感染初期和治疗停止后头四周内，这些标志物在血液 CD8+ T 细胞中的累积表达水平。在开始联合抗逆转录病毒治疗（cART）时、治疗停止后14天和研究结束时，我们比较了早期和晚期治疗组猕猴的周围淋巴结（PLN）中 CD8+ T 细胞的这些标志物的表达水平。这些结果显示为 CD8+ T 细胞的百分比或曲线下面积（AUC）；我们还探索了治疗停止后这些标志物的累积表达水平与 CD8+ T 细胞抑制 SIV 活性之间的相关性。数据展示了每组6只动物的个体结果，并显示了中位数。我们使用了双侧 Mann‒Whitney U 检验进行统计分析，结果表明了显著性的不同水平。所有源数据都以文件形式提供。
在我们的研究中，我们发现，在感染后的第4周开始进行为期两年的抗病毒治疗（ART），能显著加强 SIVmac251 感染猕猴在停止治疗后对 SIV 的长期控制。然而，如果将治疗的开始推迟到感染后六个月，ART 带来的这种益处就会大大减少。这项研究特别设计是为了比较早期与晚期开始 ART 对于治疗后控制的影响，我们的实验设置是根据我们之前针对人类艾滋病病毒感染者（PLWH）队列所作的观察而来的。
我们的研究基于一个核心假设：在 SIV 感染的猕猴中早期引入抗病毒治疗（ART），通过在限制病毒库的广度和多样性与促进免疫反应成熟之间找到一个平衡，可能是治疗停止后控制病毒的关键。以往的研究显示，猕猴在感染初期或人类在极早期感染阶段开始治疗虽然能大大限制病毒的扩散，但治疗停止后病毒仍有可能反弹。实际上，过早开始治疗（在病毒达到高峰之前）可能会阻碍抗病毒反应的形成，因此这样的治疗可能只是暂时阻止病毒扩散并推迟感染进程。
相比之下，我们认为，如果治疗在免疫反应已初步形成后再开始，可能会在病毒量迅速下降的同时，允许免疫反应得到更好的发展和保留，特别是如果治疗持续足够长，还能影响病毒库的形成。因此，选择何时开始治疗以及治疗持续多久，对于达到这种平衡至关重要。我们选择在感染后4周开始早期治疗，因为这个时间点大约是我们在ANRS VISCONTI研究中观察到的治疗后控制者开始治疗的中位时间。
我们计划进行24个月的治疗，因为我们之前的研究表明，对于在原发感染期间就开始治疗的人来说，持续数年的ART对于有效减少病毒库和实现免疫系统重建非常关键。我们还观察到，在早期ART开始后两年内，携带HIV-DNA的细胞频率稳定减少。最近的一项研究也显示，在SIV感染的猕猴中，ART的头两年内，完整SIV基因组的频率持续下降。
我们的研究发现，在感染后第4周就开始治疗的动物中，成功控制病毒的比例达到了前所未有的水平。这种控制病毒的成功率超出了我们之前对早期接受治疗的艾滋病毒感染者（PLWH）所做的回顾性估计。更重要的是，这种治疗后控制的发生率大大超过了在相同实验条件下，未接受抗病毒治疗而自然控制SIV的比例。
此外，早期开始抗病毒治疗（ART）的好处在于，仅在治疗开始时间上有所不同的猕猴组之间，我们观察到治疗后控制成功的可能性有显著差异。通过在两个不同的实验阶段对早期和晚期治疗的动物进行比较，并且得到了一致的结果，这进一步增强了我们发现的可靠性。因此，我们的研究明确指出，早期开始ART对于实现治疗后的病毒控制起到了关键作用。
虽然目前还没有找到能够准确预测停药后能否控制病毒的标志物，但有研究指出，ART治疗前较低的病毒量、HIV-DNA含量较低或ART暂停前较高的CD4/CD8比例等因素，可能与停药后病毒量较低或反弹延迟有关。
正如我们所预料，不论是接受早期还是晚期治疗的动物，在原始感染阶段的表现相似，包括病毒高峰值以及血液和PLNs中CD4+ T细胞和SIV-DNA的水平。晚期开始治疗的动物在ART开始时CD4+ T细胞数量较少，且经历了更长时间的病毒量未被控制的状态。
然而，经过两年的ART治疗，早期和晚期治疗组之间在残留病毒量、SIV-DNA水平、CD4+ T细胞数量或CD4/CD8比例上，并未发现能够解释它们不同结果的差异。特别地，感染后24周开始治疗在时间上仍然算是较早的，尤其是考虑到大多数HIV感染者是在感染数年后才开始接受ART治疗，这可能解释了为什么两组动物在ART期间这些参数能够正常化。
图6 在早期治疗中断后，观察到血液和淋巴结中中央记忆 CD8+ T 细胞的扩张。在原发 SIV 感染（顶部）和治疗中断后早期（底部），W4（A）和W24治疗（B）的猕猴血液中中央记忆（CM）（CD45RA-CD27+CCR7+）、效应记忆（EM）（CD45RA-CD27-CCR7-）和效应（CD45RA+CD27-CCR7-）CD8+ T细胞亚群的演变。在治疗中断前和治疗中断后14天，W4（C）和W24治疗（D）的猕猴周围淋巴结（PLNs）中CM、EM和效应CD8+ T细胞的频率。E 在基线时、ART启动时、治疗中断前和治疗中断后，W4和W24治疗的猕猴血液（左）和PLN（右）中CM CD8+ T细胞的细胞内Ki67水平比较。F 在治疗中断后血液中CD8+ T细胞介导的SIV抑制活动AUC与治疗中断后28天血液中（左）和14天PLNs中（右）CM CD8+ T细胞频率之间的Spearman相关性。A–F 显示了个体数据（每组6只动物）；A–E 显示了中位数；*p < 0.05, **p < 0.01; ***p < 0.001; ns非显著性；A, B 使用Friedman检验并进行Dunn校正；C,D 使用双侧Wilcoxon配对等级检验；E 使用双侧Mann‒Whitney U检验。源数据以源数据文件形式提供。
在ART中断时，无论治疗延迟时间如何，SIV的治疗后控制者（PTC）与非控制者（非PTC）之间没有发现差异。不过，我们的研究显示了治疗后控制的积极进展，尤其是在ATI后持续保持较低水平的SIV-DNA以及保留的CD4+ T细胞群体，包括血液和淋巴组织中较高频率的中央记忆CD4+ T细胞，这反映了一些长期无症状HIV感染者的特点。相反，大多数非PTC在停药几个月后往往会出现病情进展的症状。
早期治疗和晚期治疗猕猴的不同效果可能与为了抵抗病毒反弹而激活的免疫反应的变化有关。在体液免疫方面，我们发现，在原始感染阶段的抗-Env抗体水平与病毒接触的程度和时间密切相关，这一点在人类中的一些研究中也有发现。
但是，在病毒反弹后不久，所有动物的抗-gp140 IgG/IgA水平都显著提高。特别地，接受晚期治疗的动物的IgG反应整体更强烈，这可能是由于在ART开始前就有更多记忆B细胞以及更强烈的抗原刺激造成的。然而，在ART停止后，早期和晚期治疗的动物之间的抗-gp140 IgA水平没有明显差异，这可能与原始感染时激活的IgA记忆B细胞数量较少或相比于IgG记忆细胞有较短的生命周期有关。
这里观察到的抗体水平变化很可能与不同的抗原刺激有关，并不直接反映其保护作用。不过，为了更好地理解这些抗体的具体功能，我们还需要评估它们的中和能力和依赖Fc的抗病毒活性。事实上，一些早期治疗并在停药后控制病毒的个体中发现了具有中和能力和依赖Fc的效应功能的抗体。
我们的研究揭示了，在 ART 暂停后，一些特殊的 CD8+ T 细胞因其出色的抗病毒能力而可能帮助控制病毒量。虽然一开始这些 CD8+ T 细胞的反应能够在一定程度上降低病毒量，但它们也面临病毒变异逃逸的挑战，显示出它们的作用有限和特定的细胞毒作用不足。
我们之前的研究显示，无论是在 HIV 感染的人类还是 SIV 感染的猕猴中，这些细胞在原始感染期间分离出来时，在体外缺乏抑制病毒的能力。我们还发现，只有在那些能够有效控制病毒的猕猴中，这种活性才会随着时间的推移而增加，也就是说，那些变成了 SIV 控制者的猕猴。而且，CD8+ T 细胞在体外强力抑制病毒感染的能力是我们在 HIV 控制者中一直观察到的特点。
在 SIV 和 HIV-2 感染的情况下，具有强大抑制能力的 CD8+ T 细胞出现得更频繁，这可能说明某些病毒因素促进了这种细胞的发展，例如更好地激活和启动 SIV/HIV-2 的 T 细胞。我们的研究表明，经过 ART 暂停后，PTC（治疗后控制者）猕猴中的 CD8+ T 细胞也表现出了这种抗病毒能力，从而增强了它们抵抗病毒反弹的能力。
CD8+ T 细胞获得这种抑制感染能力的具体机制还需要进一步研究，但这似乎得益于早期开始 ART，可能与提高细胞的细胞毒性、提高 TCR 亲和力，以及在感染细胞存在时 CD8+ T 细胞更好的生存和增殖能力有关。
我们发现，对原始感染做出反应的 CD8+ T 细胞主要表现为效应记忆或效应细胞表型，而在早期治疗后中断治疗的 CD8+ T 细胞则呈现中央记忆细胞表型。这表明，早期并持续的治疗有助于形成中央记忆 CD8+ T 细胞，它们能够针对病毒反弹发起更有效的、类似第二波攻击的反应。
与此相反，中断治疗后在晚期治疗组中扩展的细胞依然保持效应细胞的特性。我们和其他研究人员最近发现，在 HIV 和 SIV 控制者中，有效的 CD8+ T 细胞反应与发展具有干细胞特性的类记忆 CD8+ T 细胞有关。尽管在原始感染期间发展的针对病毒的 CD8+ T 细胞并未表现出与长期记忆相关的分子特征，但我们最新的研究表明，早期开始 ART 治疗可能促进这类细胞的形成和保留。
这与近期关于早期治疗 HIV 感染者的研究报告相一致。在我们的研究中，具有长期记忆特性并且在增殖及抑制 SIV 方面能力增强的 CD8+ T 细胞，展现出了对抗病毒反弹的有效反应，同时减少了 T 细胞的过度激活。这一发现暗示，开发旨在激活具有干细胞类记忆特性的 HIV 特异性 CD8+ T 细胞的免疫疗法，可能为实现 HIV 治愈提供了一个有前景的途径。
我们的研究存在一些限制。主要是，它没有专门设计来评估我们采用的为期两年的抗病毒治疗（ART）的效果，也没有旨在精确确定启动 ART 的最佳时机，这个时机可以促进停药后的有效病毒控制。以往对 SIV 感染猕猴的研究显示，这一关键时期可能从免疫系统开始活跃的第一刻起就开始，并需要持续若干周。
尽管在本研究中，治疗中断时接受早期和晚期治疗的动物中携带 SIV-DNA 的细胞频率没有显著差异，但我们不能完全排除早期开始 ART 对病毒库的质量、分布或构成产生影响的可能性，特别是考虑到我们没有分析的组织。很多经历过 ART 暂停的人类病例能够持续保持病毒量不可检测，而有些人则会经历暂时的病毒活动。在我们的模型中，除了一个例外，所有的 SIV 控制者在 ART 暂停后都经历了病毒反弹，这可能更准确地反映了 ART 暂停后对感染的有效控制。
控制病毒的一些关键因素在猕猴和人类之间可能存在差异。例如，一些在人类艾滋病毒感染者中被认为有利于停药后 HIV 控制的免疫遗传特征，在猕猴中可能不存在。我们还没有研究先天免疫反应（如干扰素、树突状细胞、单核细胞、NK细胞等）在控制病毒中的作用，它们可能在停药后的病毒控制中发挥重要补充作用，无论是通过影响 CD8+ T 细胞的功能还是通过它们自身的抗病毒作用。
当前正在进行的额外研究旨在探索早期与晚期开始 ART 对先天免疫反应的影响。尽管如此，我们的研究表明，与自然感染控制相关的保护性 MHC 特性的存在，并不直接关联于治疗后的病毒控制，这一点与之前关于人类艾滋病毒感染者的报告相符。
简而言之，我们的研究明确证明了在原始感染阶段开始抗病毒治疗（ART）直接促进了停药后对 SIV 的控制。尽管猕猴模型可能无法涵盖人类所有的特性，但利用这个模型进行的更多研究将帮助我们深入理解导致停药后控制感染的病毒学和免疫学机制。
特别是，我们的分析发现，在早期与晚期开始 ART 的情况下，SIV 特异性 CD8+ T 细胞展现出的关键特征可能是它们对病毒反弹反应能力差异的根本原因。因此，这些发现为通过改进基于 CD8+ T 细胞的免疫治疗策略来达成 HIV 缓解目标提供了新的方向。
道德声明
CyMs从毛里求斯进口，并存放在法国Fontenay-aux-Roses的传染病模型与创新疗法(IDMIT)中心的设施中。在IDMIT进行的所有非人灵长类动物研究都符合法国国家法规，在国家兽医检查员的监督下进行(CEA许可证编号D92-032-02)。IDMIT遵守美国实验动物福利办公室实验动物护理和使用标准，具有保证编号#A5826-01和F20-00448。
所有实验程序均根据欧洲2010/63指令(推荐编号9)进行。pVISCONTI研究经法国CEA实验动物伦理委员会(A15 035声明)批准和认证，并经法国教育和研究部门注册和授权(编号2453-2015102713323361v3)。实验程序(动物操作、病毒接种和采样)在氯胺酮(Imalgene 1000®，10 mg/kg，静脉注射，Merial)麻醉后进行。在随访期间和尸检时收集组织。动物在氯胺酮麻醉后注射盐酸戊巴比妥(Doléthal，180 mg/kg，静脉注射，Laboratoire Vetoquinol)后实施安乐死。
动物和实验条件
在 pVISCONTI 研究的这个阶段，我们研究了 41 只雄性猕猴，它们加入研究时的平均年龄是 4.8 岁，年龄跨度从 3.9 到 7.2 岁不等。这些猕猴通过静脉注射的方式接种了未经克隆处理的 SIVmac251 病毒，使用的感染剂量为 1000 的 AID50。提供 SIVmac251 病毒的是来自法国斯特拉斯堡的路易斯巴斯德大学的 Anne-Marie Aubertin。
具体来说，这批病毒是从一批体外感染了 SIVmac251 的恒河猴外周血单核细胞（PBMCs）的无细胞上清液中提取的，这些 PBMCs 最初是用一种来自恒河猴 PBMCs 和一只感染了 SIVmac251 的恒河猴脾脏组织制备的混合物在体外培养产生的上清液感染的，这个混合物是由 R. C. Desrosiers 在马萨诸塞州南伯勒的新英格兰地区灵长类动物中心提供的。
这项实验设计确保了所有猕猴在最初感染期都有高病毒载量，这种情况不易于猕猴自然控制 SIV。我们使用了含有恩曲他滨（FTC）、多替拉韦（DTG）和替诺福韦前体药物替诺福韦二吡呋酯（TDF）的抗病毒治疗方案，这些药物由吉利德公司和 ViiV Healthcare 提供，通过每天一次的皮下注射进行共同给药。
治疗在感染后的第4周或第24周开始，分别对12只动物进行。猕猴接受了24个月的治疗，之后停止了治疗。接着，我们监测了动物病毒反弹的情况（即治疗停止后首次病毒载量超过400 SIV RNA 拷贝）和/或停药后的 SIV 控制情况。如果动物在病毒反弹后的某个时刻病毒载量低于400 SIV RNA 拷贝/ml（或者它们根本没有经历病毒反弹），则被认定为治疗后控制者（PTC）。
我们将400 RNA 拷贝/ml作为判断标准，这与 VISCONTI 研究中对 HIV PTCs 的定义一致。研究原计划在治疗停止后48周结束。但是，多数未能在停药后控制病毒的动物因为达到了需要实施安乐死的临床评分而在此之前被终止。不过，所有动物在治疗停止后至少被观察了6个月（参见附加图表 S1 和表格 S1）。
特别提到的是，pVISCONTI 研究的这个部分通过两个独立的实验阶段完成，每个阶段都包括了6只接受早期治疗和6只接受晚期治疗的猕猴，这些猕猴被同时进行感染、治疗和监测（具体研究方案请参见图 S1）。另外，作为自然演变的参照，我们还分析了三个实验阶段中总共17只未经治疗的猕猴（分别为5只、6只和6只），这帮助我们了解在我们的实验条件下的自然发展情况（参见表 S1）。
研究中的不同猕猴组基于年龄和 MHC 基因型进行了匹配。那些携带有利于自然控制 SIV 的 M6 基因型的猕猴没有包括在这项研究中。本研究中猕猴的详细特性可以在表 S1 中找到。有一只猕猴（CB296A）展现出非常严重的急性感染情况，并在 ART 治疗开始前就达到了需要执行安乐死的条件，因此没有包括在后续的分析中。CD8+ T 细胞反应的某些分析仅限于来自 pVISCONTI-1 实验的动物（每组6只），这些样本特别用于进行更深层次的免疫特性分析。
血液采集和处理
我们通过静脉抽血将血液收集进两种类型的试管中，一种是加有 K3EDTA 的 Vacutainer Plus 塑料试管，另一种是加有肝素钠的 Vacutainer CPT 单核细胞制备试管（由 BD Biosciences 公司生产）。我们使用加有 K3EDTA 的试管来进行所有时间点的完整血细胞计数检测。血浆是通过将含 K3EDTA 的试管离心10分钟，速度为480倍重力加速度，或将含有肝素钠的试管离心40分钟，速度为1900倍重力加速度来分离的，随后将样本存放在零下80摄氏度的条件下。
根据 BD Biosciences 公司提供的操作说明，我们从含有肝素钠的 Vacutainer CPT 单核细胞制备试管中分离外周血单核细胞（PBMCs），并使用铵-氯化钾（ACK）缓冲液（配方为0.15M NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA，pH值为7.4）来溶解红细胞。
组织采集和处理
腋下或腹股沟淋巴结、骨髓和通过支气管肺泡灌洗得到的样本，这些都是按时间顺序收集的（具体请参见图 S1）。另外，在动物解剖时，我们还收集了脾脏、肠系膜淋巴结、结肠和肝脏的样本。所有的组织样本都是在2到8摄氏度的RPMI培养基中保存的。淋巴结细胞是通过用 gentleMACS 解离器进行机械破碎后分离到RPMI培养基中的，接着通过过滤并使用ACK缓冲液去除红细胞。
骨髓细胞则是通过使用淋巴细胞分离介质进行纯化，随后也在ACK中去除红细胞。脾脏细胞的处理方法类似，但是用于从结肠黏膜中获取淋巴细胞的结肠组织在清洗和消化处理后也进行了机械破碎。肝组织经过机械破碎和过滤后，淋巴细胞通过OptiPrep梯度分离。我们对新鲜分离的细胞进行了T细胞激活、增殖和耗竭状态的评估以及体外SIV抑制能力的测定。同时，使用在极低温（-196°C）下用DMSO/胎牛血清冻存的活细胞进行了T细胞CFSE增殖试验和细胞因子胞内染色分析。
血浆病毒载量的定量
血浆中的病毒量是通过定量的 RT-PCR 技术来长期监测的，这种方法能够检测到低至12.3拷贝/mL的病毒水平。我们从100微升的无细胞血浆样本中提取了病毒 RNA。定量 RT-PCR 是采用 Thermo Fisher Scientific 生产的 SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR 试剂盒和 Bio-Rad 的 CFX96 Touch 实时 PCR 检测系统来进行的。
每个反应管中含有12.5微升的2倍反应混合物、0.5微升的 RNaseOUT 酶（浓度为40单位/微升）、0.5微升的 Superscript III 逆转录酶/Platinum Taq DNA 聚合酶、1微升的引物（浓度为125微摩尔）、0.5微升的荧光探针（浓度为135微摩尔）以及10微升的提取的 RNA。我们设计的引物和探针专门用于扩增 SIVmac251 病毒的 gag 基因的特定区域。
正向引物的序列是5′-GCAGAGGAGGAAATTACCCAGTAC-3′，反向引物的序列是5′-CAATTTTACCCAGGCATTTAATGTT-3′。探针的序列是5′-FAM-TGTCCACCTGCCATTAAGCCCGABHQ1-3′，它在5′端标记有 FAM 荧光素，而在3′端连接有 BHQ1 淬灭剂。样本先在56摄氏度下加热30分钟，接着在95摄氏度下加热5分钟，然后进行50个循环，每个循环包括在95摄氏度下保持15秒和在60摄氏度下保持1分钟。
为了估算感染的程度，我们使用了一种超敏感的实时 PCR 方法来定量总的 SIV-DNA，这个方法专门针对病毒的 gag 区域。这个过程的具体操作步骤包括先在50摄氏度下处理2分钟，然后在95摄氏度下处理10分钟，接下来是在95摄氏度下持续15秒和在60摄氏度下持续1分钟的循环。
这个方法的检测限是每次 PCR 反应1个拷贝。为了按照每百万个细胞标准化 SIV-DNA 的量，我们还通过实时 PCR 方法定量了CCR5基因，使用的循环条件与前述相同（使用的正向引物是两个引物的等摩尔混合物：5′-CAACATGCTGGTCGATCCTCAT-3′和5′-CAACATACTGGTCGTCCTCATCC-3′，反向引物是5′-CAGCATAGTGAGCCCAGAAG-3′，探针是5′-HEX-CTGACATCTACCTGCTCAACCTG-BHQ1-3′）。
两种PCR反应的体积都是50微升，包括25微升的2倍浓度的 qPCR Mastermix Plus（来自比利时 Seraing 的 Eurogentec）、0.4微摩尔的每个引物和0.2微摩尔的探针。SIV-DNA 的浓度结果以每106个细胞或CD4+ T细胞的拷贝数表示，如果SIV-DNA的浓度低于检测阈值或者没有检测到SIV-DNA，则以阈值形式报告。
我们通过专门针对病毒的 gag 基因的一步实时 PCR 方法来定量 SIV 的细胞相关 RNA（caRNA）。为了确保准确性，我们对所有的PCR扩增都进行了两次重复测试。这个过程的具体步骤包括首先在50摄氏度下处理10分钟，然后在95摄氏度下处理5分钟，之后是在95摄氏度下持续15秒和在60摄氏度下持续1分钟的循环。
这个方法能够检测到最少5个拷贝的病毒RNA。为了标准化 SIV caRNA 的数量，我们利用了核糖体 RNA，采用了 Applied Biosystems 提供的核糖体 RNA 控制试剂盒进行一步实时 PCR 测量。这个反应的总体积是20微升，其中包含5微升的4倍浓度的快速病毒1步 Taqman Master Mix、每种引物0.4微摩尔和探针0.2微摩尔。
为了进行标准化，我们使用了 SIV1C 细胞作为标准，这些细胞中每个细胞包含一个整合的 SIVmac251 前病毒 DNA 拷贝（。DNA 和 RNA 的阈值根据细胞数量和可用的总 RNA 量变化，并且每次实验都会重新计算。
同时对 SIVmac251 gp140 的 IgG 和 IgA 进行滴定
我们通过临时转染 FreeStyle™ 293-F 细胞来生产 SIVmac251 g140-foldon 类型的糖蛋白，并利用 Ni Sepharose® Excel 珠（GE Healthcare）的亲和色谱法进行了纯化。我们使用高粘附的96孔 ELISA 板（Costar, Corning），每孔涂覆250纳克的纯化重组 SIV gp140 蛋白，并让其过夜。
接着，我们用0.05% Tween 20-PBS清洗板子，然后用2% BSA、1 mM EDTA 和 0.05% Tween 20-PBS混合物封闭2小时，再次清洗后，将稀释的非人灵长类动物血清以1:250或1:50的比例开始稀释，分别进行7轮1:4或1:3的连续稀释，用于检测IgG或IgA。洗涤之后，我们通过用带有HRP的山羊抗人IgG或IgA抗体（Jackson ImmunoResearch, 0.8 µg/ml）孵育1小时来显色，然后加入100 µl的HRP显色底物（ABTS溶液，Euromedex）。
我们在405纳米波长下测量吸光度（OD405 nm），并从中减去只有PBS孵育在涂层孔中的背景值。这些实验是使用 HydroSpeed™ 微孔板洗涤器和 Sunrise™ 微孔板吸光度读取器（Tecan Männedorf, 瑞士）完成的。
SIV 抑制活性的测量
我们通过特定的磁珠和分离试剂盒，从刚提取的 PBMCs 或组织细胞悬浮液中分别精确地分离出自身的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞，使用的是 Miltenyi Biotec 公司的 MultiMACS™ Cell24 分离器。我们让纯化出的 CD4+ T 细胞在含有刀豆素 A（5 μg/mL，来自 Sigma-Aldrich）和 IL-2（100 IU/mL，来自 Miltenyi Biotec）的环境中刺激3天。
同时，纯化的 CD8+ T 细胞则在没有任何刺激物和细胞因子的条件下培养（即直接从体内取出的 CD8+ T 细胞）。之后，我们让这些被刺激的 CD4+ T 细胞（10^5个）和 SIVmac251 病毒（MOI = 10^−3）在96孔板中共同培养，这是在有或没有来自同一组织的体外 CD8+ T 细胞（10^5个）的情况下进行的，通过离心接种法在室温下进行1小时（1200 × g），接着在37°C下再孵育1小时。
处理之后，细胞被清洗并在含有 IL-2（100 IU/mL）的 R10 媒介中继续培养。7天后，我们用 SIV p27 抗原 ELISA 试剂盒（来自 XpressBio）来测试培养上清。我们通过计算没有体外 CD8+ T 细胞的 SIV 感染 CD4+ T 细胞培养物与有体外 CD8+ T 细胞的 SIV 感染 CD4+ T 细胞培养物中平均 p27 ng/mL 的对数比来评估抗病毒活性。
T细胞的激活和增殖情况是通过检查新鲜分离的PBMCs和组织细胞来评估的。我们首先用一种特殊的染色试剂对细胞进行活/死细胞染色，接着对细胞表面的CD3、CD4、CD8、CD38和HLA-DR进行标记。
为了深入了解细胞的不同分化状态，我们还对CD45RA、CCR7和CD27进行了额外染色。之后，我们用一套特定的试剂固定并使细胞渗透，以便对细胞内的Ki-67进行染色。我们使用了一系列特定的抗体来进行这些标记。所有数据都是通过LSRII流式细胞仪收集，并使用FlowJo软件进行分析的。
我们根据细胞表面标记的不同，将T细胞分为以下几种类型：朴素细胞（naive）具有CD45RA+CD27+CCR7+的标记；中央记忆细胞（CM）标记为CD45RA−CD27+CCR7+；过渡记忆细胞（TM）标记为CD45RA-CD27+CCR7-；效应记忆细胞（EM）标记为CD45RA−CD27−CCR7−；效应细胞标记为CD45RA+CD27-CCR7−。这些细胞类型帮助我们了解T细胞的激活状态和它们的功能状态。
信息来源：Front. Behav. Neurosci., 26 October 202
Sec. Pathological Conditions
Volume 17 - 2023 | https://doi.org/10.3389/fnbeh.2023.1261784
SIV特异性T细胞的细胞因子产生、记忆和增殖能力
我们研究了SIV特定T细胞产生细胞因子、它们的记忆功能以及增殖能力。首先，我们从冷冻保存的PBMCs开始，将它们解冻并在R20培养基中重新悬浮，隔夜在37°C下培养。接下来，我们用一组精选的24个SIV肽进行细胞刺激，同时加入特定的抗体以增强刺激效果，并对细胞进行特定标记以监测其反应。我们采用了特殊的试剂固定和渗透细胞，以便对它们内部的关键蛋白进行染色，这些蛋白包括那些涉及细胞因子产生的蛋白。
为了详细了解T细胞的不同分化状态，我们对它们进行了一系列的标记，包括那些标志着T细胞是否为“朴素”、“记忆”或其他类型的标记。我们利用流式细胞仪技术收集数据，并通过特定软件进行分析，以识别这些细胞的详细特性和功能状态。
我们对这些T细胞的功能进行了测试，包括它们对SIV感染的反应，如细胞因子的产生能力，以及它们的增殖能力。这项分析帮助我们理解了这些细胞如何在体内对抗SIV感染，以及它们在免疫记忆方面的潜力。通过这种详细的细胞标记和功能测试，我们可以更好地了解SIV特异性T细胞在抗病毒免疫反应中的角色。
我们通过使用CFSE染色技术（浓度为1微摩尔，来自Thermo Fisher Scientific）来检测CD8+ T细胞在受到特定刺激后的增殖情况（详见图S5）。首先，我们对PBMCs进行CFSE染色，然后用一组精心挑选的24种SIV肽（每种肽的浓度为2微克/毫升）进行刺激，并将它们培养6天。在整个孵化过程即将结束前的12小时，我们又向培养基中加入了一次肽以及其他几种物质，包括GolgiStop（浓度为1微升/毫升，来自BD Biosciences）、布雷菲尔丁A（浓度为5微克/毫升，来自Sigma-Aldrich）和一种针对CD107a的抗体。
同时，我们还设置了未经刺激的细胞作为阴性对照组。随后，我们对细胞进行了一系列染色处理，首先是用LIVE/DEAD染色试剂标记活细胞和死细胞，接着对细胞表面的几种标志物进行标记，最后用PhosFlow固定/渗透缓冲液处理细胞，并对细胞内的几种关键蛋白进行染色，包括IFNγ、TNFα、IL-2、pS6 Ser235/236和pAKT Ser473，以评估细胞的反应情况。
我们使用了一系列特定的抗体来研究CD8+ T细胞的反应和功能，包括它们在受到刺激后的增殖能力。这些抗体特别针对细胞的不同表面标记和内部信号分子，如CD3、CD4、CD8和一些关键的功能性标记，如IFNγ和TNFα。我们还使用了CFSE染色来观察细胞分裂和增殖的情况。
我们的实验包括将PBMCs暴露于一组SIV肽，并在六天后观察细胞的反应。我们对细胞进行了详细的染色，以分析它们的活性和分化状态，并使用高级流式细胞仪和专业软件进行数据采集和分析。
为了深入了解SIV特异性CD8+ T细胞如何在早期和晚期治疗的条件下形成不同的反应群体，我们运用了先进的数据分析技术，如UMAP和PhenoGraph算法，这些技术帮助我们识别了细胞反应的不同模式。
通过这项工作，我们不仅能够了解这些细胞如何响应SIV肽的刺激，还能够洞察它们的记忆和增殖能力，以及它们在免疫反应中的潜在作用。这一过程通过减去没有肽刺激的对照组来确保我们得到的数据是准确的，并且我们给予没有反应的样本一个极小的值以便于分析。这项复杂的分析工作为我们提供了宝贵的洞见，帮助我们更好地理解SIV特异性CD8+ T细胞在抵抗病毒中的角色。
数据可视化和统计分析
我们的数据是在IDMIT的BaTLab实验室管理系统中安全存储的，我们使用Tableau软件（2021.3版）来查询数据库和展示数据。我们的图表和统计分析是通过使用Prism软件（9.2.0版）和R语言（4.2.2版）来完成的。我们展示的结果会显示每个数据点及其中位数。
我们比较不同组别时使用了Mann‒Whitney U检验。而对于成对的样本，我们则使用Friedman检验和Wilcoxon配对样本等级检验来进行比较。我们的测试是双侧进行的，这意味着我们在两个方向上都考虑了结果的可能性。我们用Spearman等级分析来评估数据之间的相关性。
考虑到我们的分析具有探索性质，我们没有对多次比较进行调整。所有小于0.05的p值都被认为是统计上显著的，这表明结果具有统计学意义。
注释：
SIV: 指的是“猴免疫缺陷病毒”（Simian Immunodeficiency Virus），这是一种在非人灵长类动物中发现的病毒，与人类免疫缺陷病毒（HIV）相似。
CD8+ T细胞: 一种免疫细胞，主要负责杀死体内受病毒感染的细胞。CD8是这些细胞表面的一个标志物。
CFSE: 指的是“羧基荧光素琥珀酰亚胺酯”（Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester），这是一种用于细胞追踪和测量细胞分裂的荧光染料。
IFNγ, TNFα, IL-2: 这些都是细胞因子的名称，分别代表干扰素γ（Interferon gamma）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor alpha）和白细胞介素2（Interleukin 2）。这些细胞因子在免疫反应中扮演着关键角色。
UMAP: 表示“统一流形近似和投影”（Uniform Manifold Approximation and Projection），这是一种数据降维技术，用于高维数据的可视化。
PhenoGraph: 是一种用于细胞数据集的无监督聚类分析方法，可以帮助识别和分类细胞群体中的不同细胞类型。
MFI: 指的是“中值荧光强度”（Median Fluorescence Intensity），这是衡量流式细胞仪中单个细胞荧光标记强度的一种方法。
信息来源：Article Open access Published: 11 January 2024 Early antiretroviral therapy favors post-treatment SIV control associated with the expansion of enhanced memory CD8+ T-cells
信息来源：【互联网】
排版编辑：【高翔】
信息发布：【高翔】
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